Aplicación de la metabolómica en la urolitiasis: descubrimiento y uso del succinato

Signal Transduction and Targeted Therapy volumen 8, Número de artículo: 41 (2023) Citar este artículo

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Los cálculos urinarios se conceptualizan como un trastorno metabólico crónico puntuado por eventos de cálculos sintomáticos. Se ha demostrado que la aparición de monohidrato de oxalato de calcio (COM) durante la formación de cálculos está regulada por modificadores del crecimiento de cristales. Aunque los inhibidores de la cristalización han sido reconocidos como una modalidad terapéutica durante décadas, se ha logrado un progreso limitado en el descubrimiento de modificadores efectivos para intervenir con la enfermedad de cálculos. En este estudio, hemos utilizado tecnologías de metabolómica, un enfoque poderoso para identificar biomarcadores mediante la detección de los componentes de la progresión dinámica en la orina en un modelo de cálculo vesical. Mediante la extracción y el análisis en profundidad de los datos de metabolómica, hemos seleccionado cinco metabolitos diferenciales. A través de estudios de teoría funcional de la densidad y cristalización en masa, encontramos que tres de ellos (salicilúrico, ácido gentísico y succinato) podrían inhibir efectivamente la nucleación in vitro. Por lo tanto, evaluamos el impacto de los inhibidores con un modelo de rata inducido por EG para cálculos renales. En particular, el succinato, un actor clave en el ciclo del ácido tricarboxílico, podría disminuir la deposición de calcio en los riñones y las lesiones en el modelo. El análisis transcriptómico mostró además que el efecto protector del succinato se producía principalmente a través de la antiinflamación, la inhibición de la adhesión celular y la diferenciación osteogénica. Estos hallazgos indicaron que el succinato puede proporcionar una nueva opción terapéutica para los cálculos urinarios.

La urolitiasis es un trastorno urológico relativamente típico cuya prevalencia mundial ha aumentado continuamente durante las últimas décadas.1 También es una enfermedad con una tasa de recaída a los 5 años de hasta el 50%.2 La etiología de la urolitiasis es compleja y puede estar influenciada por obesidad, diabetes, hipertensión y síndromes metabólicos.3 Los cálculos de oxalato de calcio (CaOx) han representado más del 75% de los cálculos urinarios, seguidos por los tipos de ácido úrico, fosfato de calcio, estruvita y cistina.4 La urolitiasis es un proceso de varios pasos que implican la nucleación, el crecimiento y la agregación de cristales, aunque el mecanismo subyacente aún no se comprende por completo.5 Cómo inhibir la urolitiasis y predecir su riesgo subyacente sigue siendo un gran desafío.6

La heterogeneidad de los tipos de cálculos entre los pacientes crea la necesidad de un tratamiento personalizado, que puede incluir la regulación de la dieta/ingesta de agua, la administración de varios tipos de medicamentos aprobados por la FDA y el procedimiento quirúrgico para extraer los cálculos.7 Hoy en día, los problemas de recurrencia y la prevalencia aún suscitó una gran atención socioeconómica. Por lo tanto, es necesario buscar nuevos tratamientos.8

Junto con la búsqueda de medicamentos para la prevención y el tratamiento de los cálculos, los modificadores que pueden influir en la cristalización han atraído una mayor atención.9 Los modificadores más eficaces de los cálculos de calcio están compuestos por ácido carboxílico, grupos funcionales de sulfato que pueden interactuar con la superficie del cristal y/o complejo con iones libres en la orina.10 Muchas especies naturales y sintéticas pueden inhibir su crecimiento. Pero todavía es muy difícil unir la evidencia in vitro e in vivo. La combinación de estudios experimentales, estudios en animales y ensayos clínicos puede facilitar nuestra cognición sobre la modificación del crecimiento cristalino y su función en la cristalización.5 Hasta la fecha, solo dos moléculas, es decir, ácido poliacrílico y una molécula de fosfato de inositol divalente,10,11 han demostrado que inhibir la cristalización de CaOx al reducir la deposición renal de CaOx.

La patogénesis de la urolitiasis asociada con muchos factores metabólicos y externos. Aunque el mecanismo aún no se comprende completamente, un hecho es indudable que está influenciado por la composición de la orina.4 La orina es una especie de mezcla compleja de abundantes especies moleculares que incluyen tanto inhibidores como promotores del desarrollo de cálculos renales.12 La nefrolitiasis tiene un alto en pacientes espinal bífida que sufrieron cálculos en la vejiga después del aumento.13 El trastorno metabólico está estrechamente relacionado con los cálculos no infecciosos.14 Evaluar los efectos únicos de los inhibidores es muy difícil para la complejidad de la orina, que incluye ~3100 metabolitos de molécula pequeña, y la mitad de los cuales no ha sido identificado. La orina contiene alrededor de 1823 proteínas, de las cuales 671 son constituyentes identificados recientemente15.

La metabolómica estudia principalmente sustancias moleculares pequeñas en células y tejidos. Estas sustancias están íntimamente relacionadas con la salud del organismo y se obtienen principalmente a través del metabolismo de diversas sustancias en condiciones fisiológicas o patológicas. En la actualidad, en el campo de la terapia personalizada, las sustancias de molécula pequeña comienzan a recibir una gran atención y se convierten en la piedra angular de la investigación de biomarcadores.16,17 En el campo de la investigación renal, la metabolómica ha sido ampliamente utilizada y ha logrado resultados notables también se ha utilizado para estudiar nuevos marcadores para el diagnóstico de enfermedades renales.18 Con el rápido desarrollo de la tecnología de bioinformación, el alcance de la aplicación de la tecnología metabonómica también se está expandiendo. Por ejemplo, se ha aplicado en el campo de la investigación del mecanismo de la enfermedad y la selección de objetivos. Además, los métodos de metabolómica también tienen un alto valor de aplicación en el campo de investigación de modelos animales de cálculos de CaOx, a través del cual se identificaron muchas vías metabólicas anormales.19 Recientemente, el enfoque de metabolómica también se ha utilizado para investigar la orina de pacientes con cálculos renales, que pueden ser de alto valor para la terapia de esta enfermedad.20

Nuestros estudios previos han demostrado que los cálculos siempre se formarán en la vejiga del conejo en el período inicial (1 a 2 semanas) después del aumento de la vejiga y pueden resolverse o desarrollarse con el tiempo. era mucho más grande que la circunferencia de la uretra del conejo, y era difícil de excretar por vía autónoma, hasta que un estudio reciente sobre cristales de CaOx encontró una nueva vía de inhibición que puede conducir a la disolución de cálculos con muy pocos modificadores.22 Para identificar los nuevos inhibidores de cristales , hemos analizado las muestras de orina tanto del modelo de cálculos vesicales como del control normal mediante el uso de metabolómica no dirigida, con el objetivo de identificar nuevos objetivos para la intervención terapéutica y unir los descubrimientos in vitro e in vivo.

Hemos utilizado el PC-SIS (submucosa del intestino delgado reticulado con procianidinas) para reparar los defectos vesicales de espesor completo en un modelo de conejo para cálculos vesicales. semanas (Fig. 1b). El cálculo recolectado para visualizar el tamaño, la distribución y el componente. De la Fig. 1c, d, los cálculos tenían una forma irregular con una superficie de textura beige, mientras que el resultado de la ecografía abdominal coincidía estrechamente con la apariencia macroscópica de los cálculos. Por espectro FTIR, que puede proporcionar una caracterización confiable y resaltar la composición de los cálculos urinarios a escala atómica (Fig. 1d), el CaOx y la hidroxiapatita (HAP) son componentes típicos de las muestras. Las bandas de absorción a 1036 cm−1 se deben al estiramiento HAP, mientras que a 660 cm−1 puede corresponder a las vibraciones COM. Las bandas de diagnóstico de 1643 cm−1 (vibración C = O) y 780 cm−1 (estiramiento CC) son características del calcio. Como se descubrió, el dihidrato de oxalato de calcio (COD) ha hecho una contribución significativa a la muestra.23 Por análisis bioquímico de orina (Fig. 1e, f), el nivel de calcio ha aumentado significativamente 2 semanas después de la cirugía. Por el contrario, la concentración de calcio en sangre no difirió entre el animal modelo y los controles normales.

Los cambios dinámicos de la piedra y el análisis de componentes. a, b Imágenes representativas de la vejiga por ecografía de abdomen de control normal y modelo de litiasis vesical a las 2 y 4 semanas. c Vista macroscópica y ecografía de abdomen de la muestra de cálculo del mismo individuo. d Espectros infrarrojos y morfología macroscópica de la piedra. e, f Cuantificación del nivel de calcio en las muestras de orina y sangre. *P < 0,05 en comparación con el grupo de control. Para (e–f), n = 10 conejos en cada grupo

En particular, hasta el 70% de los cálculos han desaparecido a las 4 semanas (Fig. 1b). El tamaño de la uretra de los conejos adultos varía de 4 a 10 mm bajo diferentes presiones uretrales, que es mucho menor que el tamaño de la piedra, es difícil de excretar espontáneamente (Tabla complementaria 1).24 La formación de cálculos urinarios se somete a múltiples procesos que contiene la nucleación de cristales, la formación de cristales y la agregación, con esta última regulada por inhibidores y promotores de cristales.25 El análisis microscópico mostró evidencia de que la disolución ha ocurrido principalmente durante el proceso minerogenético de los cálculos renales.26 Esto ha contradicho el concepto ampliamente aceptado de que los cálculos no se puede disolver,27,28 y abrió un nuevo paradigma para los enfoques clínicos, donde la disolución in vivo dirigida puede aliviar la influencia dañina de la enfermedad de los cálculos. Mientras tanto, esto también nos ha llevado a reflexionar si los cambios dinámicos del cálculo pueden atribuirse a la presencia de modificadores de cristales en la orina. Como una mezcla intrincada de metabolitos, la orina contiene ~3100 moléculas pequeñas con algunos modificadores activos (inhibidores y promotores de cristales).29 Como tal, es difícil identificar los inhibidores que pueden influir en el desarrollo de cálculos patológicos.

La probable presencia de modificadores de cristales sugirió que algunas composiciones urinarias naturales, incluidos los metabolitos, pueden afectar el crecimiento de cristales y la formación de cálculos. muestras de controles normales (10 muestras) y modelos de cálculos vesicales (10 muestras) en diferentes momentos (1, 2, 3 y 4 semanas después de la cirugía de aumento de vejiga) (Fig. 2a). A partir de la Fig. 2b, los metabolitos negativos se separaron claramente entre el control normal y los grupos tratados con cirugía según el análisis de coordenadas principales (PCoA). Para este propósito, nos hemos centrado en los metabolitos negativos y cuantificado la segregación entre el control y el modelo en varios puntos de tiempo después de la cirugía mediante análisis PLS-DA, y descubrimos una diferencia obvia entre los dos perfiles (Fig. 1 complementaria). El análisis de la vía por pares (Fig. 1 complementaria) y las comparaciones de grupos múltiples (Fig. 2c) han identificado los transportadores ABC, la degradación de la lisina, el metabolismo de la fenilalanina y la vía del metabolismo de la tirosina como el enriquecimiento significativo en el KEGG. Para delinear aún más los metabolitos involucrados en las vías enriquecidas, hemos trazado los mapas de calor de los grupos de control y modelo para las cuatro vías (Fig. 2d y Fig. 1 complementaria) para revelar la diferencia en los metabolitos entre los dos grupos.

El perfil de metabolómica ha identificado cinco moléculas orgánicas como candidatas para inhibidores de cristales. un esquema que representa el diseño de experimentos de perfiles de metabolómica. b Análisis de coordenadas principales (PCoA) para los iones positivos y negativos del animal de control y modelo basado en los perfiles de metabolitos de las muestras de orina. c Análisis de enriquecimiento de la vía KEGG de los grupos de control y modelo. d Mapa de calor de los transportadores ABC, degradación de la lisina, metabolismo de la fenilalanina y ruta del metabolismo de la tirosina. e Alteración de las cinco moléculas orgánicas según los perfiles de metabolitos y el análisis estadístico, *P < 0,05 en comparación con el grupo de control. Para (a–e), n = 10 conejos en cada grupo

Los compuestos orgánicos polipróticos y el cristal pueden interactuar por electrostática en el sistema de mineralización de calcio, donde el criterio para seleccionar un inhibidor efectivo es una molécula que posee múltiples grupos cargados.30 De hecho, algunos de los inhibidores más efectivos para el cristal de calcio tenían carboxilato (-COOH), grupos funcionales hidroxilo (–OH) y/o sulfato (–OSO3–) que pueden interactuar con la superficie del cristal en la orina.31,32 Por lo tanto, seleccionamos cinco moléculas con grupos funcionales basados en el análisis de mapas de calor, que incluyeron taurina (–OH), Ácido subérico (–COOH), Succinato (–COOH), Salicilúrico (–COOH, –OH) y Ácido gentísico (–COOH, –OH) de los metabolitos expresados diferencialmente para su posterior análisis (Fig. 2e). El análisis estadístico mostró que el cambio del nivel de ácido orgánico no reveló ninguna regularidad obvia, lo que sugiere que han jugado diversos roles en la modificación de cristales.

Se utilizó la teoría funcional de la densidad (DFT) para arrojar luz sobre la acción de los modificadores. La energía de adsorción del modificador en la superficie COM (100) fue ácido gentísico > ácido salicílico > ácido succínico > ácido subérico > taurina. Las energías de unión de los modificadores en la superficie COM (021) estaban en consonancia con las de la superficie COM (100), excepto para el ácido salicilúrico y subérico (Tabla complementaria 2). En comparación con otros modificadores, la fuerza de unión entre el ácido gentísico con la superficie COM (100) y (021) (Fig. 3b, c) fue mayor. Para cuantificar la fuerza de los modificadores unidos a las superficies COM (100) y (021), hemos calculado el desplazamiento medio δ de los átomos (Tabla complementaria 3). El resultado reveló que la adsorción de todos los modificadores en la superficie (100) resultó en una mayor tensión en comparación con la superficie (021). La unión del ácido gentísico con la superficie COM ha dado lugar a la tensión más alta (100 δ = 0,418 Å; 021 δ = 0,206 Å). Por el contrario, la taurina tiene la tensión más baja (100 δ = 0,211 Å; 021 δ = 0,099 Å). Se ha demostrado previamente que bajo una tensión de tracción constante, la tensión del cristal podría reducir su tasa de crecimiento. Esto también sugirió que el efecto del ácido gentísico en la prevención del crecimiento de cristales es mejor que el de la taurina.22,33

Energía de enlace de los modificadores en la superficie COM y Ca2+. a Las estructuras optimizadas de COM, taurina, ácido subérico, ácidos succínico, salicilúrico y gentísico. b, c Estructuras optimizadas de las moléculas en la superficie COM (100) y COM (021), con las bolas de color rosa claro, azul claro, marrón, azul, amarillo y rojo que indican H, Ca, C, N, S y átomos de O, respectivamente. d Espectros de fotoelectrones de rayos X (XPS) de taurina, ácido subérico, ácidos succínico, salicilúrico y gentísico adsorbidos en Ca2+. Los picos ajustados en azul, rosa y rojo corresponden a los picos C1s de C = O, C–O y C–C, respectivamente

Además de las interacciones de la superficie COM, este estudio también analizó la coordinación de modificadores con Ca2+ (Figura complementaria 2a, Tabla complementaria 4). Los cálculos indicaron que el ácido gentísico, el salicilúrico y el succinato mostraron una mayor afinidad por el complejo de iones Ca2+ en comparación con el ácido subérico y la taurina. La unión del ácido gentísico con Ca2+ fue más enérgica. Los tipos de interacción de modificadores y Ca2+ se detectaron en base a la espectroscopia XPS (Fig. 3d, Fig. 2b complementaria y Tabla 5). La energía de enlace en la espectroscopia XPS se basa en un pequeño cambio químico causado por las cargas atómicas. Por lo tanto, está asociado con la carga atómica neta.34 Nos hemos centrado en los cambios en los picos C1s de ácido orgánico calcio y ácido orgánico con C = O que pueden interactuar con Ca2+. El rango de cambio de C = O de ácido orgánico y calcio de ácido orgánico reflejó el tamaño de la energía de unión y la tendencia de cambio de la siguiente manera: ácido gentísico > salicílico > succinato > ácido subérico > taurina con la misma tendencia que los cálculos DFT. Teniendo en cuenta la diversidad de efectos inhibidores de los modificadores, necesitamos demostrar aún más el efecto inhibidor de los modificadores a través de experimentos in vitro e in vivo.

Con o sin modificadores, la cristalización en masa se detecta a través de un microscopio para determinar los cambios correspondientes en el tamaño y la morfología del cristal. Esta tecnología no necesita realizar una operación de invasión al analizar la cristalización, para analizar el efecto del modificador de manera más eficiente y precisa. Mediante micrografía óptica, la taurina y el ácido subérico no mostraron ningún efecto aparente sobre la morfología y el área del cristal en comparación con el control. Por el contrario, el succinato, el ácido salicírico y el ácido gentísico han generado cristales clásicos de forma tetragonal (Fig. 4a, b). Esto ha reflejado la inhibición en la tasa de crecimiento de cristales y la supresión subyacente de la nucleación COM (Fig. 4b, 4c). El mecanismo clásico de crecimiento de cristales incluía la nucleación en capas 2D y el paso avanzado a través de planos de cristal. La presencia de inhibidores en la superficie del cristal puede dificultar la formación y el crecimiento de los cristales.35 La microscopía de fuerza atómica (AFM) de la topología de la superficie del cristal (Fig. 4e) mostró que los cristales de control y Taurina tenían los cambios más pequeños en profundidad (dentro de 3 nm), aunque hay defectos en la superficie del cristal. Tras la intervención con ácido gentísico y succinato, se puede observar un evidente crecimiento de cristales. El defecto superficial de los cristales tratados con ácido gentísico fue el más grande, con un rango de alrededor de 8 nm. Se pueden observar grietas regulares profundas (profundidad: 5 nm) en los cristales de succinato durante las etapas de crecimiento, lo que se puede atribuir a que los inhibidores de cristal han cambiado la dirección del crecimiento del cristal y, además, han reducido la estabilidad de la estructura cristalina.

Inhibición de la nucleación de COM in vitro. Micrografías ópticas (barra de escala: 20 μm) y SEM (barra de escala: 2 μm y 4 μm). b–d Análisis semicuantitativo del área cristalizada y el número y proporción de COM y COD (COM—CaOx monohidrato, COD—CaOx dihidrato, nd—no definido), *P < 0,05 en comparación con el grupo control. e Imágenes AFM de (001) crecimiento superficial e inhibición con o sin el modificador (barra de escala: 400 nm). f Espectros FTIR con o sin el modificador

Los estudios anteriores han prestado atención principalmente a la influencia de los inhibidores en la cristalización de COM, nuestro análisis se concentró predominantemente en la inducción de COM y COD. Para evaluar esto último, hemos medido la relación de COM. Como se muestra en la Fig. 4d, tanto la taurina como el ácido subérico han promovido significativamente la nucleación de COM (52 % ± 5 % y 49 % ± 15 %, respectivamente) en comparación con el control normal (36 % ± 8 %). El succinato, el ácido salicírico y el ácido gentísico dieron lugar a <30 % de nucleación de COM y >37 % de nucleación de DQO en comparación con el control normal (13 % ± 2 %), lo que confirmó su efecto inhibitorio sobre la nucleación de COM. Los experimentos FTIR (Fig. 4f) también revelaron un cambio de cristalización mayoritariamente COM a mayormente COD con succinato, ácido salicírico y ácido gentísico en el sistema de cristalización a granel. El pico de absorción a 660 cm-1 en la región de la huella dactilar indicó que la mayor parte de la fase cristalina era COM. Además, 914 y 780 cm−1 fueron picos de absorción de DQO. Los espectros FTIR de los grupos de taurina fueron similares, con los picos de absorción característicos a 660 cm-1 que indican que la mayor parte de la fase cristalina del cristal CaOx era COM. Después de agregar ácido salicílico, subérico, ácido gentísico y succinato, los picos de absorción de la solución cristalina cambiaron de 1617 y 1322 cm−1 a 1643 y 1330 cm−1, lo que indica que la adición de modificadores ha llevado a un aumento de la DQO, lo que fue consistente con la caracterización de la morfología del cristal.36 Los cristales de CaOx tienen dos formas comunes: COM y COD. La DQO se une menos a la inestabilidad, y mientras que la COM se une más fácilmente a las células epiteliales renales y puede agregarse para formar cálculos.37 Por lo tanto, un método para suprimir la formación de cálculos puede ser seleccionar modificadores que puedan atacar la cristalización de CaOx así como inducir la formación de cálculos. formación de DQO. En comparación con el control, la mayor inestabilidad de los cristales de DQO con la adición de succinato, ácido salicílico y ácido gentísico ha sugerido un papel potencial para el tratamiento de cálculos renales.

Hemos seleccionado modificadores con inhibición de cristales in vitro (ácido salicílico, gentísico y succinato) para evaluar si los compuestos orgánicos polipróticos tienen un impacto en la formación de cristales inducida por EG. El ácido cítrico, el componente principal del fármaco de intervención de cálculos Ulaite, se aplicó como grupo de intervención. Se trataron ratas Sprague-Dawley con inhibidores (200 mg/kg) o NaCl al 0,9% mediante alimentación forzada diaria. Mientras tanto, las ratas del grupo experimental y del grupo modelo aceptaron una solución de EG al 1 % para inducir la formación de cristales. Cuatro semanas más tarde, se analizó el aspecto bruto (Fig. 5a) y el peso (Fig. 5c) de los riñones de rata, así como el peso corporal (Fig. 5b) para evaluar el estado básico de las ratas. Tanto el ácido cítrico como el succinato han mostrado un efecto protector para el modelo de rata inducido por EG, el grupo de intervención con succinato tenía una apariencia, peso y peso corporal de los riñones similares a los del control normal, mientras que el ácido salicílico y el ácido gentísico no mostraron un efecto significativo para la protección renal. . Mientras que los modelos de ratas inducidas por EG tratadas con NaCl, ácido salicílico y ácido gentísico han desarrollado cálculos en 4 semanas, aquellos tratados con ácido cítrico y succinato mostraron una inhibición significativa para la formación de cálculos, junto con un nivel más bajo de BUN en sangre y creatinina en plasma (Fig. 5d-h ).

El succinato ha reducido la deposición de cristales renales y la lesión en el modelo de cristalización de CaOx de rata tratada con EG. a Aspecto macroscópico de los riñones. b, c Peso corporal y renal, *P < 0,05 en comparación con el grupo de control; # P < 0,05 en comparación con el grupo modelo. d Imagen de micro-CT, e, f Se tiñeron secciones de riñón de rata para la deposición de cristales mediante tinción de Von Kossa (barra de escala: 400 μm) y se cuantificaron las áreas oscuras del cristal, # P < 0,05 en comparación con el grupo modelo. g, h Nitrógeno ureico en sangre plasmática (BUN) y creatinina (CREA), *P < 0,05 en comparación con el grupo de control; # P < 0,05 en comparación con el grupo modelo

Además, hemos evaluado la influencia de los modificadores en las funciones renales en varios grupos de ratas. Mediante la tinción de Von Kossa (Fig. 5e, f, Fig. 3 complementaria), había abundantes cristales de cristal en el área del borde entre la corteza y la médula en ratas tratadas con EG. En comparación con el ácido cítrico, el ácido salicílico y el ácido gentísico, la deposición de cristales de CaOx fue obviamente menor en el grupo de succinato después del tratamiento con EG (P < 0,05). La lesión renal se detectó mediante tinción con ácido peryódico de Schiff (PAS) y se calificó para lesión tubular (Figuras complementarias 4a, 4b). Como era de esperar, la lesión renal se redujo significativamente con 4 semanas de dieta enriquecida con succinato en comparación con las ratas tratadas con EG. En particular, el nivel de lesión renal se redujo aún más con el tratamiento con succinato en comparación con el grupo de ácido cítrico, lo que sugiere una mayor salida de oxalato de los tejidos renales, lo que concuerda con la lesión renal más leve. Por inmunohistoquímica (IHC), las intensidades de CD44, IL-6 y OPN (Fig. 5 complementaria) aumentaron en los túbulos del grupo tratado con EG que en el grupo de control. La administración de succinato ha inhibido significativamente la expresión de CD44, IL-6, lo que concuerda con el resultado del análisis histológico y funcional.

El impacto global del succinato en la reprogramación del transcriptoma del modelo de rata durante la formación de cristales se midió en función del ARN-seq de tejidos renales recolectados 4 semanas después del tratamiento con EG. Los resultados del análisis de la ruta y la Q-PCR sugirieron que, si bien los genes expresados diferencialmente (DEG) en el grupo de succinato se enriquecieron significativamente para el metabolismo de los aminoácidos (Fig. 6a, c, Fig. 7 complementaria), mientras que los del grupo de succinato se enriquecieron significativamente para respuesta inmune y moléculas de adhesión célula-célula (Fig. 6b, c, Fig. 7 complementaria) en comparación con el modelo tratado con EG, que ejerció un efecto protector sobre la lesión renal. Mediante el análisis de RNA-seq, el grupo tratado con EG mostró un enriquecimiento similar para las vías que incluyen proinflamatorias, moléculas de adhesión y células de diferenciación de osteoclastos, etc. en el riñón modelo en comparación con los controles (Fig. 6a complementaria), pero en la dirección opuesta en términos de vía metabólica de aminoácidos (Fig. 6b complementaria).

Reversión del daño renal inducido por EG por succinato como se ilustra por secuenciación de ARN. a, b Análisis de enriquecimiento de términos de ontología génica (GO) de los procesos biológicos influenciados por el tratamiento con succinato y EG basado en el conjunto de datos de RNA-seq. Procesos regulados hacia arriba (izquierda) y hacia abajo (derecha) en el grupo tratado con succinato en comparación con el grupo modelo tratado con EG. c Diagrama de puntos que muestra la comparación de la vía GSEA por pares del conjunto de datos RNA-seq del grupo modelo tratado con succinato y EG y los controles correspondientes. Los puntos azules y rojos representaron respectivamente las vías reguladas hacia abajo y hacia arriba. d Un diagrama de dispersión que muestra el cambio de expresión de DEG entre el grupo modelo tratado con EG y el grupo succinato según el conjunto de datos de RNA-seq. e Mapas de calor que muestran la expresión de genes asociados con eventos inflamatorios, apoptóticos y de supervivencia en los tejidos de riñón de rata de los grupos tratados con EG y tratados con succinato según el análisis de RNA-seq. Para (a–e), n = 3 ratas en cada grupo

Además, la función de mejora del succinato en la lesión renal, incluida la respuesta inflamatoria, las moléculas de adhesión y la diferenciación de osteoclastos después del tratamiento con EG, se revirtió en gran medida. Esto se verificó mediante un análisis de mapa de calor relacionado con el transcriptoma en el que los cambios en el nivel de genes en el grupo modelo fueron revertidos en gran medida por el succinato. Como se muestra, los genes que participan en el metabolismo de los aminoácidos se enriquecieron principalmente en el grupo succinato. Por el contrario, el modelo tratado con EG mostró una fuerte correlación con la lesión renal (es decir, la inducción de genes), con el enriquecimiento de genes asociados con el daño celular (Fig. 6d, e). Los gráficos de dispersión y los análisis de mapas de calor sugirieron que, entre los DEG, los de los grupos de control obviamente estaban enriquecidos para el metabolismo de los aminoácidos celulares, mientras que los que estaban regulados a la baja en los riñones del grupo modelo obviamente estaban enriquecidos para las moléculas de adhesión y la diferenciación de osteoclastos en comparación con el grupo tratado con EG. (Fig. 6d, e complementarias).

Los eventos principales en el desarrollo de cálculos urinarios incluyen la nucleación de cristales, el crecimiento de cristales y la adhesión de células cristalinas.38 Al actuar sobre los sitios de interacción en la superficie del cristal, los inhibidores de la cristalización pueden proporcionar un enfoque alternativo para reducir la tasa de crecimiento de cristales. Sin embargo, hasta el momento no ha habido ningún tratamiento para la cristalización de CaOx que pueda usarse para el tratamiento de la enfermedad de cálculos urinarios.22,39 piedra) a piedra (cálculo renal). Entre estos, el ácido succínico, salicílico y el ácido gentísico han mostrado el efecto de inhibición de cristales in vitro. Cabe señalar que cuando se usó ácido cítrico como control para el tratamiento de cálculos renales de rata inducidos por EG, el ácido succínico mostró una excelente inhibición de la deposición renal de calcio además de un efecto protector. El análisis transcriptómico ha demostrado además que el efecto protector del succinato se produce principalmente a través de la antiinflamación, la inhibición de la adhesión celular y la osteogénesis y la regulación del metabolismo de los aminoácidos.

Recientemente se han desarrollado varios modificadores del crecimiento de cristales, más comúnmente inhibidores, que van desde pequeñas moléculas y péptidos hasta proteínas. Las moléculas con carboxilatos, los grupos funcionales de fosfatos han ejercido una importante función de prevención del crecimiento de cristales de COM.38,40 Con base en este criterio y una selección estricta, un análisis en profundidad de los datos de metabolómica no objetivo mostró que la taurina, el ácido subérico, el succínico, el salicilúrico El ácido y el ácido gentísico con grupos sulfato y carboxilato pueden interactuar con la superficie del cristal para afectar su crecimiento. Comparar la eficacia in vitro de los inhibidores de la cristalización de CaOx es un desafío debido a la diferencia de métodos y parámetros de prueba. En este estudio, hemos combinado el cálculo teórico DFT y las pruebas de cristalización en masa COM para evaluar de manera integral el efecto inhibitorio de cada modificador. Basado en el mecanismo por el cual la adsorción del inhibidor impuso la mancha en la superficie del cristal.41,42 La tensión de la unión del modificador en las superficies COM (100) y (021) mostró que el ácido gentísico, el ácido salicílico y el succinato mostraron un desplazamiento medio más alto (en Å ) lo que indica que las interacciones de los cristales son más energéticas que la taurina y el ácido subérico. Además, calculamos la capacidad de unión de cada molécula a Ca2+, que estaba en consonancia con la tendencia de los resultados de XPS. La fuerza de la capacidad de unión de las moléculas pequeñas al Ca2+ dependía principalmente de la electronegatividad del oxígeno en el C = O. Cuanto mayor sea la electronegatividad, mayor será la energía de unión al Ca2+. Los resultados del ensayo de cristalización indicaron que el ácido succínico, salicilúrico y el ácido gentísico podrían disminuir el tamaño y la cantidad de cristales, lo que concordaba con estudios previos de inhibidores de la cristalización de COM.43,44 Durante la cristalización, el ácido succínico, salicilúrico y el ácido gentísico pueden cambiar COM hacia la cristalización de DQO, lo que puede conferir un efecto terapéutico ya que la DQO tiene menor afinidad con las moléculas de la membrana celular epitelial y, por lo tanto, puede reducir la retención intratubular.11,45,46

Para explorar el efecto del inhibidor de cristales sobre los cálculos renales in vivo, hemos construido un modelo de rata inducido por EG, en el que se utilizó EG para inducir el depósito excesivo de oxalato en los túbulos renales. El oxalato precipitado en los túbulos renales es el principal factor de riesgo de la formación de cálculos renales de CaOx.47 Se aplicaron inhibidores de cristales y citrato a los modelos de rata para evaluar su efecto sobre los cálculos renales. Entre estos, el citrato es un tipo de inhibidor bien conocido que inhibe la generación de cálculos renales al combinarse con iones Ca2+, lo que lleva a que menos calcio libre se una al oxalato.48,49 Los cambios en la morfología renal en ratas inducidas por EG mejoraron con la aplicación de succinato. Descubrimos que el succinato revirtió drásticamente la deposición de CaOx inducida por EG y redujo la lesión y la apoptosis de las células tubulares. Los efectos citoprotectores del succinato se confirmaron además in vivo por la disminución de los niveles de creatinina sérica. El mecanismo protector del succinato sobre la deposición y lesión de CaOx en el riñón fue investigado más a fondo por RNAseq. Una sorprendente regulación positiva de la inflamación, la adhesión celular y la osteogénesis fue causada por el riñón inducido por EG. El succinato antiinflamatorio y osteogénico evitó casi por completo el cambio en los niveles de genes, así como la regulación positiva de los genes relacionados con el metabolismo de los aminoácidos. El succinato reguló a la baja los niveles de expresión de los genes relacionados con la osteogénesis, incluidos IL-1, IL-6 y OPN, que está muy relacionado con la lesión renal y la deposición de CaOx in vivo. los niveles de CD68 y CD44 pueden proporcionar una nueva vía para inhibir la deposición de CaOx en los riñones.52 Los resultados justifican una mayor investigación del efecto protector del succinato sobre los cálculos renales y su modulación.53

En este estudio, hemos identificado un nuevo succinato inhibidor de cristales con una eficacia excepcional y hemos demostrado su efecto in vivo sobre la deposición de CaOx. El succinato se muestra prometedor como una terapia eficaz para prevenir los cálculos renales. Hasta ahora, solo se ha llevado a cabo un estudio de modelo piloto de cálculos renales en ratas, con el objetivo de verificar el efecto inhibitorio sobre la deposición y lesión de CaOx en el riñón. Sin embargo, el efecto de succínico en otros órganos urinarios, en particular la vejiga, ha quedado por verificar. Al mismo tiempo, será interesante (e importante) confirmar si la administración de succinato también puede suprimir la progresión de los cálculos renales y alterar la metabolómica de la sangre periférica y la orina en otros modelos animales. En el estudio de seguimiento, se requiere una mejor comprensión de las vías metabólicas del succinato en humanos, el régimen de dosificación óptimo y la tolerabilidad antes de realizar ensayos clínicos prospectivos de succinato en este campo. También estamos muy interesados en los objetivos posteriores del succinato, que vale la pena explorar y pueden proporcionar un camino para avanzar en su traducción clínica.

Cloruro de calcio (CaCl2, 97%), oxalato de sodio (Na2C2O4, 99,5%), ácido cítrico (C6H8O7, 99%), COM (CaC2O4·H2O), salicilúrico (C7H6O3, 99%), succinato (C4H6O4, 99%), El ácido gentísico (C9H9NO5, 98 %), la taurina (C2H7NO3S, 99 %), el ácido subérico (C8H12O4, 99 %), el cloruro de sodio (NaCl, AR) y el EG (C2H6O2, 99,8 %) se compraron a Sigma Aldrich.

Todos los experimentos fueron aprobados por el Comité de Ética de la Universidad de Sichuan (número de registro 2018190 A). Veinte conejos blancos machos de Nueva Zelanda (2,5 ± 0,5 kg cada uno) se dividieron aleatoriamente en los grupos de control normal y modelo de cálculos vesicales. Después de un período de cuarentena de 2 semanas, los animales de experimentación se mantuvieron en ayunas durante 12 h antes de la cirugía. Posteriormente, fueron anestesiados mediante una inyección de pentobarbital sódico (2 mL/kg). Se hizo una incisión de tamaño apropiado en la parte inferior del abdomen para exponer la vejiga. Luego, se eliminó la pared vesical de espesor total parcial y se estableció el modelo de defecto de la pared posterior requerido. Después de la esterilización, PC-SIS de 1 mg/mL se suturó completamente con sutura soluble (5-0, Johnson, EE. UU.) 22 para obtener cuatro líneas de sutura (5-0 Monocryl) sin diferencia obvia, para marcar los defectos de la espalda. pared y servir de apoyo para el análisis posterior. Se suturó el músculo y la piel. Después de la operación, todos los animales de experimentación se volvieron a colocar en la jaula y se alimentaron libremente. Se inyectó penicilina por vía intramuscular durante tres días consecutivos. En diferentes puntos de tiempo (1, 2, 3 y 4 semanas), la orina de conejo se recolectó en una jaula metabólica de conejo para análisis metabolómicos no dirigidos. Las muestras de orina se recogieron en tubos EP de 1,5 ml y se centrifugaron a alta velocidad durante media hora a 4 °C. Las muestras se mantuvieron en un ambiente de -80 °C. Además, se recolectaron muestras de orina y sangre para análisis de calcio en orina y sangre.

El cálculo vesical se detectó mediante ecografía a las 2 y 4 semanas. Y la solución salina tibia y estéril se inyectó en la vejiga hasta que se logró la máxima distensión. La ecografía se realizó con un sistema de ultrasonido (Philips, Best, Países Bajos). Las muestras se recolectaron, molieron y detectaron con un sistema mejorado de análisis de piedras (Lanmode LIR-20) con un rango de longitud de onda de 500–4000 cm−1 basado en el método de prensado de gránulos de KBr.

Para el análisis metabolómico no dirigido, se mezcló una alícuota de 1 ml de muestra de orina de conejo con 1 ml de solución de acetonitrilo/metanol/agua (2:2:1, v/v), se mezcló en vórtex, se sonicó durante 30 min, se mantuvo a -20ºC. °C durante 1 h, posteriormente se centrifugó a alta velocidad durante media hora a 4 °C. Luego se secó al vacío. Para la espectrometría de masas, a la muestra seca se le añadieron 100 μL de acetonitrilo (1:1, v/v) para resolver y se centrifugó a 15 000 × g durante 20 min a 4 °C.

La metabolómica no dirigida se obtuvo mediante el uso de un sistema de cromatografía líquida de propiedades ultraaltas (UHPLC; Infinity LC; CA, EE. UU.) espectrómetro de masas emparejado (TOF 6600; AB Sciex, Concord, Canadá). Los metabolitos de la orina se separaron en condiciones optimizadas a 4 °C con una dosis de 2 μL. El caudal fue de 0,3 ml/min, el programa de separación cromatográfica: 0–1 min, 85% B; 1–12 min, 85–65% B; 12–12,1 min, 65–40 % B; 12,1–15 min, 40% B; 15–15,1 min, 40–85 % B; 15,1–20 min, B al 8 % (A, acetato de amonio 25 mM e hidróxido de amonio en agua; B, acetonitrilo). Durante el análisis UHPLC-MS, la temperatura de control es de 4 °C. Durante el análisis de espectrometría de masas, se seleccionó la fuente ESI y se realizaron diferentes modos de detección a la temperatura de la fuente de 600 °C.

Una vez determinados los datos originales, se utiliza la herramienta ProteoWizard para convertirlos y obtener datos en formato. formato mzML. Luego, el XCMS se usa para realizar operaciones de alineación y corrección de picos, y se extrae la información relacionada con el área del pico. Para el extracto XCMS, elimine el pico de iones correspondiente cuando se considere que el valor faltante es >50 %. En el reconocimiento de patrones, se aplica el software SIMCA-P 14.1 y se utiliza el método de escala de Pareto para preprocesar los datos, y luego se lleva a cabo el análisis estadístico, que incluye principalmente el análisis PCA y PLS-DA. El método PLS-DA se utiliza principalmente para determinar la calidad R2 y Q2, así como la importancia variable (VIP). VIP describe principalmente los cambios de las reacciones de estímulo patológico explicadas por metabolitos específicos. Al evaluar el metabolito con una diferencia significativa, los criterios de evaluación establecidos se establecieron como VIP > 1 y P < 0,05. Los metabolitos expresados diferencialmente se normalizaron para obtener grupos con patrones de expresión similares. El mapa de calor se derivó mediante la agrupación de metabolitos expresados diferencialmente en función del software R. El análisis KEGG se realizó en la prueba hipergeométrica, las vías con P < 0,05 se consideraron significativas.

CaCl2 y Na2C2O4 se disolvieron respectivamente en agua desionizada para formar una solución madre de 10 mM. La cristalización a granel del sistema de reacción de 10 ml se realizó en viales de vidrio limpios. En primer lugar, se añadió una solución acuosa de NaCl 150 mM al vial, luego se añadieron 0,7 ml de solución de CaCl2 mientras se mezclaba uniformemente. Posteriormente, los viales de vidrio se colocaron en la incubadora a 60 °C durante 1 h antes de dejar caer 0,7 ml de solución madre de Na2C2O4. Se añadieron al sistema de reacción inhibidores de cristal, por ejemplo, taurina, ácido subérico, succinato, ácido salicílico y ácido gentísico, en una cantidad adecuada antes de la adición de Na2C2O4 y la solución final contiene inhibidor de cristal 1,5 mM. Para recolectar los cristales, se colocaron portaobjetos de vidrio limpios en el fondo del vial. Después de incubar a 60 °C durante 3 días, los portaobjetos se retiraron y luego se lavaron y secaron a 25 °C para su posterior caracterización.

La morfología y la densidad de los cristales se analizaron primero con un microscopio óptico (Ti2-U, Nikon, Japón). El área y el número de cristales en al menos cinco campos se estimaron con el software Image J. Además, se analizó la relación entre COM y oxalato de calcio dihidratado (COD) contando todos los cristales. La morfología de los cristales en el portaobjetos de vidrio fue examinada más a fondo por SEM (EVO, ZEISS, Alemania) después del tratamiento de pulverización catódica con oro. En particular, se observaron y fotografiaron dos tipos diferentes de oxalato de calcio, a saber, COM y COD. Para evaluar más a fondo el efecto de varios inhibidores de cristal en la cristalización de CaOx, se llevó a cabo microscopía de fuerza atómica (AFM, Asylum Research, EE. UU.) para examinar imágenes topográficas de la superficie del cristal (001), en particular el fenómeno de grabado. Las imágenes se recopilaron utilizando las puntas con 60 N/m de constantes de resorte en el modo de tapping (rango de exploración: 2 μm; velocidad de exploración: 0,5 Hz).

La estructura de los cristales se validó con XPS (Kratos, Reino Unido) y espectroscopia infrarroja por transformada de Fourier (FTIR, INVENIO R, Suiza). El espectro FTIR de varios cristales COM se midió con un alcance de longitud de onda de 1000–4000 cm−1. En cuanto a XPS, el espectro C 1s, N 1s y O 1s de varios cristales de COM, taurina, ácido subérico, succinato, ácido salicílico y ácido gentísico se ajustaron utilizando el software CasaXPS.

Se utilizó la teoría del funcional de la densidad (DFT) para explorar teóricamente las interacciones entre varios inhibidores de cristal y la superficie de CaC2O4.42 Se aplicó el funcional de aproximación de gradiente generalizado (GGA). Se aplicó el método Monkhorst-Pack en el proceso de muestreo de la zona de Brillouin. El estándar de convergencia de energía fue de 10−5 eV/átomo.

Se calcularon las energías de unión de las moléculas inhibidoras de cristales, incluidos los ácidos succínico, taurino, salicílico, subérico y gentísico, en las superficies de CaC2O4. Las superficies CaC2O4 (100) y (021) fueron construidas por las supercélulas 2 × 2 y 2 × 1, respectivamente. Se aplicó un espacio de vacío de 15 Å para evitar interacciones. Se aplicó el método DFT-D2 para calcular las interacciones vdW entre las moléculas inhibidoras de cristal y la superficie de CaC2O4. Mientras que la fórmula de las energías de enlace (Eb) fue la siguiente:

donde \(E_{\left( {\rm{Molecule}} - {\rm{CaC}}_{2}{\rm{O}}_4\right)}\), y \(E_{{\rm {CaC}}_2{\rm{O}}_4}\) se refieren a las energías DFT de la molécula adsorbida en la superficie de CaC2O4, la superficie limpia de CaC2O4, respectivamente.

Este estudio ha comparado geométricamente las estructuras congeladas y relajadas de la superficie de CaC2O4 con o sin la presencia de adsorbatos (inhibidor del crecimiento), como se indica en nuestro trabajo anterior. Se utilizó una métrica de distancia para cuantificar el desplazamiento de los átomos relajados en la superficie del cristal de CaC2O4. El desplazamiento promedio δ se puede calcular mediante la siguiente fórmula:

Donde Natoms se refiere al número de átomos relajados en la superficie del plano CaC2O4.

Además, las energías medias de desplazamiento y unión entre Ca2+ y las moléculas inhibidoras de cristales (es decir, taurina, ácido subérico, succinato, ácido salicílico, ácido gentísico) se derivaron con un método similar.

Ratas macho SD compradas en Chengdu Dossy Animals Factory, y se clasificaron en el grupo de control en blanco, el grupo modelo de cálculos renales y los grupos de tratamiento (ácido cítrico, taurina, ácido subérico, succinato, ácido salicílico y ácido gentísico), y cada grupo contenía al menos cinco ratas. Se usó etilenglicol para construir el modelo de cálculos renales con las ratas SD.54 Específicamente, el modelo se construyó alimentando continuamente con agua potable que contenía 1% v/v de EG durante 28 días, mientras que el grupo de control se alimentó solo con agua potable. Durante la modelación se realizó tratamiento con ácido cítrico, taurina, ácido subérico, succinato, ácido salicílico y ácido gentísico, respectivamente. La dosis inhibidora (200 mg/kg) utilizada para el modelo de cálculos renales en ratas se calculó en función de la concentración terapéutica clínica de ácido cítrico (el componente eficaz de uralyt-U) que se convirtió para ratas en función del área de superficie corporal. Posteriormente, las ratas fueron tratadas con soluciones acuosas de taurina, ácido subérico, succinato, ácido salicílico y ácido gentísico mediante alimentación forzada diaria durante 28 días. Todas las ratas estaban vivas durante todo el experimento. Se registró el peso inicial de cada rata y se ajustó la cantidad de fármaco por sonda de acuerdo con su peso diario.

Las ratas fueron anestesiadas, fijadas en posición supina, con el corazón completamente expuesto. Se recogieron 3 ml de sangre del ventrículo derecho con un tubo de recogida de sangre al vacío desechable y se recogieron los riñones. Las muestras se dejaron a 25 °C durante 15 min y se centrifugaron durante 15 min. Se aspiró 1 ml de sobrenadante para ensayos bioquímicos. La morfología de los riñones se registró mediante fotografía. Y cada riñón fue pesado y registrado. A continuación, los riñones se almacenaron en una solución fijadora de paraformaldehído al 4 % o se congelaron para su posterior análisis.

Las muestras de riñón se fijaron en una solución de formalina al 10 % para la inclusión en parafina y se seccionaron a un espesor de 10 μm para la tinción. La formación de cristales se detectó en base a la tinción de Von Kossa. Los depósitos de cristales se analizaron mediante microfotografía óptica y el software Image J. Las secciones de riñón se sometieron a (tinción PAS y la lesión tubular se calificó mediante el método de PaIIer: dilatación tubular y células epiteliales planas (1 punto); yeso tubular (2 puntos); células necróticas y exfoliadas en la luz tubular sin residuos (1 punto). ), picnosis de células epiteliales (1 punto).55

Para la inmunohistoquímica (IHC), las secciones de riñón se incubaron en xilol, etanol en gradiente y luego en H2O2 al 3% para bloquear la actividad de la peroxidasa endógena. Los anticuerpos CD44 (ab189524, Abcam), IL-6 (ab9324, Abcam) y OPN (ab11503, Abcam) se incubaron a 4 °C durante la noche. La sección se enjuagó en PBS y se incubó con anticuerpos secundarios conjugados con HRP a una dilución de 1:200 durante 1 h a 37 °C, expuesto a DAB para la detección de HRP conjugado. Y las imágenes fueron evaluadas con la herramienta Image J.

Cuatro semanas después de la operación, se recolectaron riñones de rata del grupo de control, el grupo de modelado y el grupo de ácido succínico (n = 3). En el proceso de extracción del RNA total se utilizó el kit RNeasy (Qiagen, Alemania) para conservar el RNA obtenido a ultra baja temperatura. De acuerdo con las instrucciones correspondientes, TruSeq se sintetizó a través del kit de ARN correspondiente (Illumina, EE. UU.). En este experimento de síntesis, en primer lugar, el ARNm que contenía poli A se purificó mediante perlas magnéticas. Luego, en base al esquema del kit correspondiente, el ARNm se fragmentó al azar para obtener ADNc de doble cadena. Luego se realizó la reparación de extremos y tratamiento de cola dA para dar soporte a las operaciones posteriores. El producto se purificó y enriqueció mediante PCR para obtener la biblioteca de ADNc requerida. Se aplicó Qubit al análisis cuantitativo de la biblioteca purificada. Se utilizó un fluorómetro ® 2.0 (Life Tech, EE. UU.) y un analizador 2100 (Agilent, EE. UU.) para verificar la biblioteca y luego calcular y analizar la concentración molar. Después de diluir la biblioteca purificada, cBot generó grupos y los analizó. En el proceso de secuenciación se utilizó NovaSeq 6000 (Illumina, EE. UU.).

Utilice Hisat2 para asignar el archivo de secuencia de terminal emparejado (fastq) al genoma de referencia de Ensembl y luego convierta el archivo SAM de salida para obtener el archivo BAM. Durante la clasificación, se aplica SAMtools 1.3.1 para convertir las lecturas mapeadas para formar el archivo BAM, que brinda soporte para el análisis FPKM posterior. Los genes fueron analizados por la herramienta StringTie1.33b. El análisis de expresión diferencial (DEG) para el ARNm se realizó en base al paquete R edgeR, y los genes con un cambio de más de 1,5 y P < 0,05 se consideraron como DEG. El gráfico volcánico se dibujó con el paquete de software EnhancedVolcano. La expresión génica estandarizada de FPKM se obtuvo procesando con herramientas de agrupamiento en el paquete R, y los grupos de genes con expresión similar se determinaron sobre esta base. En el mapa de calor, los datos de expresión génica se normalizan mediante la fórmula y = (x-α)/λ, en la que x se refiere a la expresión real, λ corresponde a la varianza de las muestras. La herramienta en línea Metascape se utiliza para el análisis de enriquecimiento GO. El conjunto de datos de DEG se analizó mediante RNA seq y se determinó su distribución. Cuando P es <0,05, la vía se considera significativa

El ARN total se aisló de las muestras de riñón mediante el reactivo TRzol y el ADNc se preparó mediante transcripción inversa basada en el kit PrimeScript™ (Takara, Japón). Q-PCR se realizó en un sistema Lightcycler 96 (Roche, Suiza) para detectar la expresión génica a nivel de ARNm. Los cebadores se pueden ver en el apéndice Tabla complementaria 6. El programa de ciclos térmicos: 95 °C durante 30 s; 40 ciclos de 95 °C por 10 s y 60 °C por 30 s. El nivel relativo de expresión génica por Q-PCR se calculó con un método 2−ΔΔCt.

Todos los datos se expresaron como media ± DE. La diferencia estadística se verificó con la prueba t independiente o el análisis de varianza unidireccional con la prueba de Tukey usando SPSS 11.0. El umbral significativo se fijó en 0,05.

Todos los datos de esta investigación se presentaron en el documento y/o en la Información complementaria. Los datos sin procesar de RNA-seq se depositaron en la base de datos SRA con el código de acceso PRJNA874063 y los datos metabolómicos no dirigidos originales se depositaron en MetaboLights con el número de acceso MTBLS5921.

Ye, Z. et al. El estado y las características de la composición de los cálculos urinarios en China. Internacional BJU 125, 801–809 (2020).

Artículo CAS Google Académico

Li, H. et al. SLIPS-LAB-A sistema de bioanálisis bioinspirado para la evaluación metabólica de la enfermedad de cálculos urinarios. ciencia Adv. 6, eaba8535 (2020).

Artículo CAS Google Académico

Johri, N. et al. Una actualización y guía práctica para el manejo de cálculos renales. Nephron Clin. Pr. 116, c159–c171 (2010).

Artículo Google Académico

Yu, H., Fan, X., Zhao, L. & Guo, X. Un nuevo método de reconocimiento de gestos con las manos basado en sEMG de 2 canales. Tecnología Cuidado de la salud 26, 205–214 (2018).

Artículo Google Académico

Alamani, BG & Rimer, JD Modificadores moleculares de cálculos renales. actual Opinión. nefrol. Hipertensión. Rev. 26, 256–265 (2017).

Artículo CAS Google Académico

Duan, X. et al. (1)Estudio metabolómico basado en RMN H de perfiles metabólicos para la orina de pacientes con cálculos renales. Urolitiasis 48, 27–35 (2020).

Artículo CAS Google Académico

Moe, OW Cálculos renales: fisiopatología y manejo médico. Lancet 367, 333–344 (2006).

Artículo CAS Google Académico

Morgan, MS & Pearle, MS Manejo médico de cálculos renales. BMJ 352, i52 (2016).

Artículo Google Académico

Geng, X., Sosa, RD, Reynolds, MA, Conrad, JC y Rimer, JD El alginato como inhibidor verde de la nucleación de barita y el crecimiento de cristales. mol. sist. Des. Ing. 6, 508–519 (2021).

Artículo CAS Google Académico

Kleinman, JG, Alatalo, LJ, Beshensky, AM & Wesson, JA El polianión ácido poli(ácido acrílico) previene la deposición de cristales de oxalato de calcio. Riñón Int. 74, 919–924 (2008).

Artículo CAS Google Académico

Kletzmayr, A. et al. Inhibidores de la cristalización del oxalato de calcio para el tratamiento de las nefropatías por oxalato. Adv. ciencia 7, 1903337 (2020).

Artículo CAS Google Académico

Fleisch, H. Inhibidores y promotores de la formación de cálculos. Riñón Int 13, 361–371 (1978).

Artículo CAS Google Académico

Salamá, AK et al. Incidencia de nefrolitiasis después del aumento de vejiga en personas con espina bífida. J. Pediatría. Urol. 521, e521–521.e527 (2021).

Google Académico

Szymanski, KM et al. Los cálculos en la vejiga después del aumento de vejiga no son lo que parecen. J. Pediatría. Urol. 98, e91–e96 (2016).

Google Académico

Posada-Ayala, M. et al. Identificación de una firma metabolómica en orina en pacientes con enfermedad renal crónica en estadio avanzado. Riñón Int. 85, 103–111 (2014).

Artículo CAS Google Académico

Cacciatore, S. & Loda, M. Innovación en metabolómica para mejorar la atención médica personalizada. Ana. N.Y Acad. ciencia 1346, 57–62 (2015).

Artículo CAS Google Académico

Krzyszczyk, P. et al. El papel cada vez mayor de la medicina de precisión y personalizada para el tratamiento del cáncer. Tecnología (Singap. Word Sci.) 6, 79–100 (2018).

Google Académico

Abbiss, H., Maker, GL & Trengove, RD Enfoques metabolómicos para el diagnóstico y comprensión de las enfermedades renales. Metabolitos 9, 34 (2019).

Artículo CAS Google Académico

Gao, S. et al. Análisis metabolómico de la nefrolitiasis de oxalato de calcio inducida por hidroxi-L-prolina en ratas basado en cromatografía líquida de ultra alta resolución espectrometría de masas de tiempo de vuelo cuadripolar. ciencia Rep. 6, 30142 (2016).

Artículo CAS Google Académico

Wang, X. et al. Identificación de biomarcadores en orina para urolitiasis de oxalato de calcio en adultos basados en UPLC-Q-TOF/MS. J. Chromatogr. Anal B. Tecnología biomedicina Ciencias de la vida 1124, 290–297 (2019).

Artículo CAS Google Académico

Zhang, XZ et al. Submucosa de intestino delgado reticulada con procianidinas: un parche vesical promueve la regeneración del músculo liso y la restauración de la función vesical en un modelo de conejo. Bioact. Mate. 6, 1827–1838 (2021).

Artículo CAS Google Académico

Chung, J. et al. Los modificadores moleculares revelan un mecanismo de inhibición patológica del crecimiento de cristales. Naturaleza 536, 446–450 (2016).

Artículo CAS Google Académico

Mijangos, F., Celaya, MA, Gainza, FJ, Imaz, A. & Arana, E. Barrido lineal SEM-EDX: una nueva herramienta para el análisis morfocomposicional de bandas de crecimiento en cálculos urinarios. J. BioInorg. química 25, 705–715 (2020).

Artículo CAS Google Académico

Mackiewicz, AG, Klekiel, T., Kurowiak, J., Piasecki, T. y Bedzinski, R. Determinación de las condiciones de carga del stent en la uretra de conejo blanco de Nueva Zelanda. Función J. Biomateria. 11, 70 (2020).

Artículo Google Académico

Singh, VK & Rai, PK Técnicas de análisis de cálculos renales y el papel de los elementos principales y traza en su patogénesis: una revisión. Biografía. Rev. 6, 291–310 (2014).

Artículo CAS Google Académico

Sivaguru, M. et al. La geobiología revela cómo los cálculos renales humanos se disuelven in vivo. ciencia Rep. 8, 13731 (2018).

Artículo Google Académico

Evan, AP, Worcester, EM, Coe, FL, Williams, J. Jr. y Lingeman, JE Mecanismos de formación de cálculos renales humanos. Urolitiasis 43 (Suplemento 1), 19–32 (2015).

Artículo Google Académico

Khan, SR et al. Cálculos renales. Nat. Dis. rev. Remilgado. 2, 16008 (2016).

Artículo Google Académico

Bouatra, S. et al. El metaboloma de la orina humana. PLoS ONE 8, e73076 (2013).

Artículo CAS Google Académico

Chung, J., Sosa, R. & Rimer, JD Elucidación de los efectos de la especiación del ácido poliprótico en la cristalización del oxalato de calcio. cristal. Crecimiento Des. 17, 4280–4288 (2017).

Artículo CAS Google Académico

Sosa, RD, Geng, X., Conrad, JC, Reynolds, MA y Rimer, JD Supresión de la cristalización de sulfato de bario con hidroxicitrato: un inhibidor dual de nucleación y crecimiento. química Mate. 33, 6997–7007 (2021).

Artículo CAS Google Académico

Chen, XW, Huang, WB, Sun, XY, Xiong, P. y Ouyang, JM Actividad antioxidante de los polisacáridos sulfatados de Porphyra yezoensis y su efecto regulador sobre el crecimiento de cristales de oxalato de calcio. Mate. ciencia Ing. C. Mate. Biol. aplicación 128, 112338 (2021).

Artículo CAS Google Académico

Ristić, RI, Sherwood, JN & Wojciechowski, K. Evaluación de la tensión en pequeños cristales de clorato de sodio y su relación con la dispersión de la tasa de crecimiento. J. Cryst. Crecimiento 91, 163–168 (1988).

Artículo Google Académico

Ou, Y. et al. Inhibición de la macromolécula heparina urinaria en la agregación de cristales nano-COM y nano-COD. Moléculas 20, 1626–1642 (2015).

Artículo Google Académico

Nguyen, VH et al. Un ensayo semicuantitativo para medir la degradación de glicosaminoglicanos por la microbiota urinaria. Frente. Infección celular. Microbiol. 11, 803409 (2021).

Artículo CAS Google Académico

Guerra, A. et al. Nefrolitiasis de calcio idiopática con composición de oxalato de calcio puro: correlatos clínicos de la proporción de cálculos de oxalato de calcio dihidrato/monohidrato (COD/COM). Urolitiasis 48, 271–279 (2020).

Artículo CAS Google Académico

Li, S. et al. Una nueva perspectiva del ácido gálico en la nucleación de oxalato de calcio. cristal. Crecimiento Des. 20, 3173–3181 (2020).

Artículo CAS Google Académico

Shtukenberg, AG, Hu, L., Sahota, A., Kahr, B. & Ward, MD Interrupción del crecimiento de cristales a través del reconocimiento molecular: terapias de diseño para la prevención de cálculos renales. Cuenta química Res. 55, 516–525 (2022).

Artículo CAS Google Académico

Li, S. et al. Descubrimiento de moléculas inhibidoras de la cristalización patológica de cálculos renales de CaOx a partir de extractos naturales de hierbas medicinales. J. Etnofarmaco. 284, 114733 (2022).

Artículo CAS Google Académico

Buchalski, B. et al. Los efectos de la inactivación de la hidroxiprolina deshidrogenasa en la excreción urinaria de oxalato y glicolato en modelos de ratón con hiperoxaluria primaria. Biochim Biophys. Acta Mol. Base Dis. 1866, 165633 (2020).

Artículo CAS Google Académico

Fernández, D., Ortega-Castro, J. & Frau, J. Estudio teórico de la potencia de inhibición del crecimiento de cristales de HAP de pirofosfato, etidronato, citrato y fitato. Descifrado la conformación adsorbida del fitato en la superficie HAP (001). aplicación Navegar. ciencia 408, 110–116 (2017).

Artículo Google Académico

Chung, J. et al. Factores que diferencian la eficacia de los ácidos polipróticos como inhibidores de la cristalización del oxalato de calcio en la enfermedad de cálculos renales. cristal. Crecimiento Des. 18, 5617–5627 (2018).

Artículo CAS Google Académico

Zaki, S., Jahan, N., Kalim, M. & Islam, G. Actividad antilitiática in vitro del extracto hidroalcohólico de la corteza de Cinnamomum zeylanicum Blume sobre la cristalización de oxalato de calcio. J.Integr. Medicina. 17, 273–281 (2019).

Artículo Google Académico

Chaiyarit, S. & Thongboonkerd, V. Las modificaciones oxidativas cambian las actividades moduladoras de las proteínas urinarias de inhibir a promover la cristalización, el crecimiento y la agregación de oxalato de calcio. mol. Proteoma celular. 20, 100151 (2021).

Artículo CAS Google Académico

Chen, Z., Wang, C., Zhou, H., Sang, L. & Li, X. Modulación de la cristalización de oxalato de calcio por el té verde de consumo común. Crystengcomm 12, 845–852 (2010).

Artículo CAS Google Académico

Li, Z., Chang, L., Ren, X., Hu, Y. y Chen, Z. Modulación de la cristalización de cálculos renales de rata y la vía del estrés oxidativo relativo por el polifenol del té verde. ACS omega 6, 1725–1731 (2021).

Artículo CAS Google Académico

Brent, J. et al. Fomepizol para el tratamiento de la intoxicación por etilenglicol. NEJM 340, 832–838 (1999).

Artículo CAS Google Académico

Alexander, RT, Fuster, DG & Dimke, H. Mecanismos subyacentes a la nefrolitiasis cálcica. año Rev. Fisiol. 84, 559–583 (2022).

Artículo CAS Google Académico

Vasudevan, V., Samson, P., Smith, AD y Okeke, Z. El marco genético para el desarrollo de la nefrolitiasis. Asiático J. Urol. 4, 18–26 (2017).

Artículo Google Académico

Chen, DHC, Kaung, H.-LC, Miller, CM, Resnick, MI y Marengo, SR Análisis de micromatrices de cambios en el fenotipo renal en el modelo de urolitiasis en ratas con etilenglicol: potencial y peligros. Internacional BJU 94, 637–650 (2004).

Artículo CAS Google Académico

Sáenz Medina, J. et al. Urolitiasis y disfunción endotelial renal. Modelo experimental de rata con hiperoxaluria. EUR. Urol. 79, S327 (2021).

Artículo Google Académico

Zhao, YW et al. La preprotección de los polisacáridos del té con diferentes pesos moleculares puede reducir la adhesión entre las células epiteliales renales y los nanocristales de oxalato de calcio. óxido. Medicina. Celúla. Longev. 2020, 1817635 (2020).

Google Académico

Carney, EF La homeostasis del succinato protege contra la litogénesis y la hipertensión. Nat. Rev. Nephrol. 15, 255–255 (2019).

Google Académico

Le Dudal, M. et al. El estiripentol protege contra la nefrolitiasis por oxalato de calcio y la intoxicación por etilenglicol. J. Clin. Invertir. 129, 2571–2577 (2019).

Artículo Google Académico

Desanti De Oliveira, B. et al. Nefrología molecular: tipos de lesión tubular aguda. Nat. Rev. Nephrol. 15, 599–612 (2019).

Artículo CAS Google Académico

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Este estudio ha sido patrocinado conjuntamente por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (Subvención No. 32171351), el Proyecto "1.3.5" para Disciplinas de Excelencia, West China Hospital, Universidad de Sichuan (Subvención No. ZYJC18002), Med-X Innovation Programa del Centro Med-X para Materiales, Universidad de Sichuan (Subvención No. MCM202104), el Proyecto financiado por la Fundación de Ciencias Postdoctorales de China (2022M722277) y el Fondo de Innovación interdisciplinario postdoctoral de la Universidad de Sichuan. Agradecemos a la Sra. Lei Wu y Bo Su de Histology and Imaging Platform, Core Facilities of West China, Universidad de Sichuan, al Sr. Yun-fei Tian y Shu-guang Yan del Centro analítico y de pruebas de la Universidad de Sichuan, Universidad de Sichuan, y a la Sra. Nian-guo Zhu del Instituto de Salud Respiratoria, Hospital de China Occidental, Universidad de Sichuan por los apoyos técnicos. Agradecemos a Xi-jing Yang y Xiao-ting Chen del Centro de Experimentación Animal del Hospital de China Occidental por su ayuda en los experimentos con animales.

Laboratorio de Ingeniería de Células Madre y Tejidos, Instituto de Investigación Ortopédica, Departamento de Ortopedia, Laboratorio Estatal de Bioterapia, Hospital de China Occidental, Universidad de Sichuan, Chengdu, Sichuan, 610041, China

Xiu-zhen Zhang, Xiong-xin Lei, Yan-lin Jiang, Long-mei Zhao, Chen-yu Zou, Ya-xing Li, Rui Wang, Qian-jin Li, Qiu-zhu Chen, Ming-hui Fan, Yu- ting Song, Wen-qian Zhang, Jesse Li-Ling y Hui-qi Xie

Departamento de Urología, Instituto de Urología, Hospital de China Occidental, Universidad de Sichuan, Chengdu, Sichuan, 610041, China

yun jin bai

Centro de Investigación del Hospital de China Occidental, Universidad de Sichuan, Chengdu, Sichuan, 610041, China

yi zhang

Departamento de Genética Médica, Segundo Hospital Universitario de China Occidental, Chengdu, Sichuan, 610041, China

Jesse Li-Ling

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XZZ, HQX y JLL concibieron la idea y prepararon el manuscrito. XZZ, XXL y CYZ construyeron un modelo y análisis de cálculos renales en ratas. XZZ, YLJ y YJB construyeron un modelo y análisis de cálculos en la vejiga de conejo. XZZ, LMZ, CYZ, RW, QJL y QZC realizaron análisis y cristalización de COM. XZZ, XXL, CYZ, LMZ, RW y QJL fueron los escritores principales, con contribuciones de todos los autores. Todos los autores aprovaron el manuscrito final. XZZ, LMZ y XXL llevaron a cabo un procesamiento de metabolómica no dirigido y datos de RNA-seq.

Correspondencia a Hui-qi Xie.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Reimpresiones y permisos

Zhang, Xz., Lei, Xx., Jiang, Yl. et al. Aplicación de la metabolómica en la urolitiasis: descubrimiento y uso del succinato. Sig Transduct Target Ther 8, 41 (2023). https://doi.org/10.1038/s41392-023-01311-z

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Recibido: 09 Septiembre 2022

Revisado: 04 enero 2023

Aceptado: 10 de enero de 2023

Publicado: 21 enero 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41392-023-01311-z

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