Las estructuras cristalinas revelan mecanismos catalíticos y reguladores de la doble

Nature Communications volumen 13, Número de artículo: 4880 (2022) Citar este artículo

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La enzima E1 Uba6 inicia la transducción de señales al activar la ubiquitina y la proteína similar a la ubiquitina FAT10 en un proceso de dos pasos que involucra catálisis secuencial de adenilación y formación de enlaces tioéster. Para obtener información mecanicista sobre estos procesos, determinamos la estructura cristalina de un complejo humano Uba6/ubiquitina. Se observan dos arquitecturas distintas del complejo: una en la que Uba6 adopta una conformación abierta con el sitio activo configurado para la catálisis de la adenilación, y una segunda conformación cerrada drásticamente diferente en la que el sitio activo de la adenilación se desmonta y reconfigura para la catálisis de la formación de enlaces tioéster. . Sorprendentemente, una molécula de hexakisfosfato de inositol (InsP6) se une a un sitio alostérico previamente no identificado en Uba6. Nuestros datos estructurales, bioquímicos y biofísicos indican que InsP6 inhibe alostéricamente la actividad de Uba6 al alterar la interconversión de las conformaciones abiertas y cerradas de Uba6 al mismo tiempo que mejora su estabilidad. Además de revelar los mecanismos moleculares de catálisis por Uba6 y la regulación alostérica de sus actividades, nuestras estructuras proporcionan un marco para desarrollar inhibidores específicos de Uba6 y plantean la posibilidad de regulación alostérica de otros E1 por metabolitos celulares naturales.

La modificación postraduccional (PTM) de proteínas por ubiquitina (Ub) y proteínas similares a Ub (Ubls) respalda la regulación de procesos celulares fundamentales, incluido el control del ciclo celular, la reparación del ADN, la transducción de señales y la inmunidad1. La conjugación Ub/Ubl requiere interacciones secuenciales y actividades de cascadas paralelas de enzimas que comprenden E1, E2 y, con mayor frecuencia, E3, que juntas activan, transportan y ligan Ub/Ubl a proteínas diana2. Los dos Ub E1 humanos, Uba1 y Uba6, funcionan como guardianes de la cascada de conjugación de Ub al acoplar la hidrólisis de ATP (adenilación) con la formación de un enlace tioéster E1-Ub de alta energía (tiolación). A esto le sigue la transferencia de Ub activado a distintos repertorios de enzimas E2 afines (transtioesterificación)3,4,5,6,7,8,9. Mientras que Uba1 es específico para la activación de Ub, Uba6 exhibe doble especificidad para Ub y FAT10 5,8, siendo este último un Ubl involucrado en la progresión mitótica10, la inmunidad11,12,13,14 e implicado en el cáncer15,16,17,18,19 ,20,21.

Si bien Uba6 ha eludido la caracterización estructural hasta la fecha, una gran cantidad de estudios han demostrado que Uba1 es una gran enzima multidominio en la que cada dominio desempeña un papel funcional distinto durante la catálisis de la adenilación de Ub22,23, la formación de enlaces tioéster E1~Ub24,25,26, y transtioesterificación E1-E2-Ub27,28,29,30. Los dominios de adenilación activos e inactivos (AAD e IAD, respectivamente) son responsables del reclutamiento inicial de Ub y también albergan la maquinaria catalítica para la adenilación del extremo C-terminal de Ub en el primer paso de la activación de Ub. El dominio Cys de E1 está dispuesto como dos semidominios globulares denominados semidominios de cisteína catalítica primero y segundo (FCCH y SCCH, respectivamente). El dominio FCCH juega un papel en el reconocimiento de Ub y el dominio SCCH alberga el residuo catalítico de cisteína involucrado en la formación del enlace tioéster de Ub durante el segundo paso de la activación de Ub. Estudios recientes han revelado que los E1 experimentan grandes cambios conformacionales que son necesarios para la adenilación y la formación de enlaces tioéster24,25,31,32. Los estudios de Uba125, así como de E1 para Ubl SUMO, han demostrado que la adenilación se produce con E1 en una conformación "abierta" y que la formación de enlaces tioéster implica una rotación de ~130° (o "cierre") del dominio SCCH que hace pasar la cisteína catalítica al sitio activo31. Por último, el dominio de pliegue de ubiquitina (UFD) está involucrado en el reconocimiento molecular de E2 y la posterior transferencia de Ub de la cisteína catalítica E1 a E226,27,28,29,30. Se predice que Uba6 albergará una organización de dominio similar a la de Uba1 según el análisis de secuencias5. Sin embargo, en ausencia de datos estructurales, se desconocen los mecanismos moleculares por los cuales Uba6 activa Ub y FAT10. Además, mientras que casi todo el Uba1 en las células de mamíferos en proliferación se encuentra en el estado Uba1~Ub activado, Uba6 solo se activa en un 50 % en condiciones similares6,33. Queda por determinar la base molecular de esta diferencia.

Dado el papel crucial que juega la conjugación de Ub en la regulación de una miríada de procesos celulares en humanos, tal vez no sea sorprendente que la maquinaria enzimática responsable de la conjugación de Ub esté sujeta a múltiples capas de mecanismos reguladores que permiten el ajuste fino y la modulación de su función34 ,35. Las enzimas E1, E2 y E3 que funcionan en múltiples vías Ub/Ubl, así como los propios sustratos Ub/Ubls, están reguladas por PTM, como fosforilación, acetilación, desamidación, ribosilación de ADP, ubiquitinación, SUMOilación y NEDDilación34,35. Además de los PTM, se sabe que varias moléculas pequeñas naturales regulan las vías Ub/Ubl. Por ejemplo, los miembros de la familia más grande de ligasas E3 Ub, las ligasas cullin-RING E3 Ub (CRL), están reguladas negativamente por el hexakisfosfato de inositol (InsP6) y otros fosfatos de inositol36,37,38,39. Específicamente, las CRL son desactivadas por la denedilación mediada por el signalosoma COP9 e InsP6 sirve como cofactor que promueve la interacción CRL/COP938,39. También se ha revelado que InsP6 e InsP5 interactúan directamente con las subunidades adaptadoras de sustrato de las plantas CRL SCFTIR1 y SCFCOI1, desempeñando un papel estructural en el apoyo a la función de TIR1 y COI1 como receptores de auxina y jasmonato, respectivamente36,37. Teniendo en cuenta el ritmo constante del descubrimiento de PTM y los mecanismos reguladores de la señalización de Ub mediados por moléculas pequeñas y la relativa escasez de estudios centrados en Uba6, los mecanismos que gobiernan la actividad de Uba6 siguen siendo desconocidos.

Para obtener información sobre la base molecular por la que Uba6 cataliza la activación de Ub/FAT10, determinamos la estructura cristalina de 2,25 Å de un complejo Uba6/Ub humano. El complejo Uba6/Ub se observa en dos conformaciones drásticamente diferentes: una conformación abierta preparada para la adenilación y un complejo cerrado preparado para la formación de enlaces tioéster. Además, observamos una molécula de inositol hexakisfosfato (InsP6) unida a un bolsillo altamente básico conservado evolutivamente exclusivo del dominio Uba6 SCCH. Los contactos con InsP6 en la conformación abierta implican varios residuos y elementos estructurales que se reorganizan durante la formación de enlaces tioéster y residuos importantes para la catálisis. También encontramos que InsP6 inhibe alostéricamente la actividad de Uba6 al alterar la interconversión de las conformaciones abiertas y cerradas de Uba6 al mismo tiempo que mejora su estabilidad. En conjunto, nuestros estudios revelan la base estructural de las actividades catalíticas de Uba6 e inesperadamente revelan un mecanismo único de regulación alostérica por un metabolito celular natural que explota las características mecánicas específicas de Uba6.

Para dilucidar los mecanismos moleculares por los cuales Uba6 activa Ub/FAT10, buscamos determinar una estructura cristalina de un complejo Uba6/Ub humano. En nuestros estudios estructurales se utilizó un mutante catalítico de cisteína a alanina de Uba6 humano (C625A) capaz de catalizar la adenilación pero no la formación de enlaces tioéster (tiolación) (Fig. 1a) para reducir la heterogeneidad de la muestra y facilitar la cristalización. En nuestros estudios estructurales se utilizó Uba6C625A humano recombinante derivado de células de insecto, ya que los rendimientos de proteína fueron significativamente más altos en comparación con la expresión en bacterias. Antes de realizar los ensayos de cristalización, se mezcló Uba6C625A humano con Ub y ATP·Mg2+ para promover la adenilación y se obtuvieron cristales con calidad de difracción que albergaban dos complejos en la unidad asimétrica (AU). Después de una extensa selección y refinamiento, se determinó una estructura del complejo Uba6C625A/Ub humano con una resolución de 2,25 Å, con valores R/Rlibres de 0,166/0,206 y una geometría excelente (Tabla complementaria 1). La Ub de ambas copias del complejo humano Uba6C625A/Ub en la AU exhibió una densidad de electrones fuerte y continua en sus terminales C, consistente con el producto de adenilato de Ub. Por el contrario, la densidad de electrones correspondiente al grupo saliente de pirofosfato (PPi) y Mg2+ estaba ausente (Fig. 1a complementaria). Así, los complejos representan el complejo producto de la adenilación, tras la liberación de PPI y Mg2+.

a Representación esquemática de la reacción de formación de tioéster Uba6~Ub. b Representación de dibujos animados de la estructura cristalina de Uba6/Ub-AMP/InsP6 en la conformación E1 abierta. el dominio IAD está en pizarra; AAD está en rosa; FCCH está en rosa intenso; SCCH está en magenta; UFD está en naranja; cys cap está en cian; y Ub(a) está en oro. La cisteína catalítica se indica con una esfera amarilla. AMP e InsP6 se ​​indican mediante esferas. c Representación de dibujos animados de la estructura cristalina de hUba6/Ub-AMP en la conformación E1 cerrada presentada como en b. Los dibujos esquemáticos de la organización del dominio de Uba6 con regiones desordenadas indicadas por cuadros sombreados se muestran en la parte inferior de b y c.

Sorprendentemente, las dos copias del complejo humano Uba6C625A/Ub-adenilato en la AU cristalográfica exhiben arquitecturas drásticamente diferentes entre sí (Fig. 1b, c). En una copia, el sitio activo de adenilación está completamente ordenado y el dominio SCCH adopta una conformación "abierta" donde la cisteína catalítica (C625A) está a más de 35 Å del enlace glicilo-fosfato de Ub-AMP que es atacado nucleofílicamente durante el enlace tioéster. formación (Fig. 1b). De aquí en adelante nos referiremos a esta conformación competente en adenilación del complejo Uba6C625A/Ub-adenilato humano como Uba6OPEN/Ub-AMP. En la otra copia del complejo en la AU, el sitio activo de adenilación se desensambla parcialmente y el dominio SCCH adopta una conformación "cerrada" que exhibe una rotación de cuerpo rígido de 136° (en relación con Uba6OPEN/Ub-AMP). Esto coloca el carbono β de la cisteína catalítica (C625A) ~ 4 Å del enlace glicilo-fosfato de Ub-AMP y trae elementos estructurales adicionales importantes para la formación de enlaces tioéster en el sitio activo (Fig. 1c). De aquí en adelante nos referiremos a esta conformación competente en tiolación del complejo como Uba6CERRADO/Ub-AMP. Una comparación adicional muestra que la UFD de la estructura Uba6CLOSED/Ub-AMP experimenta una rotación de cuerpo rígido de 22° hacia el dominio SCCH, en relación con la estructura Uba6OPEN/Ub-AMP (Fig. 1b, c). Estos cambios estructurales dan como resultado que el cañón entre el dominio UFD y SCCH se reduzca en longitud de ~35 Å en la estructura Uba6OPEN/Ub-AMP a ~24 Å en la estructura Uba6CLOSED/Ub-AMP (Fig. 1c). Una sorpresa adicional en la estructura Uba6OPEN/Ub-AMP fue la presencia de una fuerte densidad de electrones correspondiente a una molécula de inositol hexakisfosfato (InsP6) ubicada en el dominio SCCH (Fig. 1b). Por último, una región de bucle ordenada dentro del dominio SCCH que ocluye la cisteína catalítica en la estructura Uba6OPEN/Ub-AMP (denominada "cys cap") se desordena en la estructura Uba6CLOSED/Ub-AMP. A continuación se analiza cómo los cambios conformacionales observados y la unión por parte de InsP6 se ​​relacionan mecánica y funcionalmente con la actividad de Uba6.

En general, la interacción Uba6/Ub es similar a la de Uba1/Ub22,23 y para obtener información sobre la doble especificidad de Uba6 para Ub y FAT10, creamos un modelo Uba6/FAT10 acoplando FAT10 (PDB: 6GF2)40 en Ub de la estructura Uba6/Ub (Figura complementaria 1d, e). El modelo Uba6/FAT10 y el análisis de secuencia revelan que FAT10 alberga solo un 31 % de identidad en las posiciones Ub que interactúan con Uba6 (Fig. 1f complementaria). Entre las muchas regiones de divergencia entre Ub y FAT10, el parche hidrofóbico Ile44 de Ub (Leu8/Ile44/Val70), que se sabe que es crucial para la activación Uba1 de Ub41 y participa en una red similar de interacciones hidrofóbicas en Uba6/Ub estructura, no se conserva en FAT10 (Fig. 1d-f complementaria). En FAT10, la región correspondiente al parche Ub Ile44 ha divergido para ser mucho más polar y comprende Ser95, Thr132 y Ala159. Por lo tanto, la misma red de contactos hidrófobos funcionalmente importantes en la que participa Ub con Uba1 y Uba6 no es posible para FAT10. Además de las diferencias en muchos otros residuos Ub que interactúan con Uba6 en la estructura Uba6/Ub, FAT10 tiene una inserción de dos residuos en el bucle β1-β2 que está cerca del AAD de Uba6 donde puede participar en interacciones únicas ( Figura complementaria 1d-f) y un motivo "CYCI" único en el extremo C-terminal que desempeña un papel en la especificidad42. Por último, FAT10 difiere de Ub en que alberga dos dominios similares a Ub en tándem (NTD y CTD) conectados por una región enlazadora (Fig. 1e complementaria) que estudios previos han demostrado que es crucial para la activación de FAT10 por Uba640 a pesar de estar situado bastante lejos de la superficie de la enzima. Precisamente cómo las diferencias antes mencionadas en FAT10 CTD afectan su modo de unión a Uba6, cómo el enlazador NTD-CTD y posiblemente el propio NTD podrían desempeñar un papel en la unión de Uba6, y si estas diferencias pueden compensar la falta del parche hidrofóbico Ile44 en FAT10 esperará la determinación de una estructura Uba6/FAT10.

El dominio SCCH está unido a los dominios de adenilación de Uba6 mediante dos bucles flexibles. Estos se denominan bucle cruzado, que alberga la cisteína catalítica y conduce al comienzo del dominio SCCH, y bucle de reentrada, que conecta el dominio SCCH de nuevo con los dominios de adenilación (Fig. 2a). Como se señaló anteriormente, el dominio SCCH sufre una rotación de 136° (también denominada alternancia de dominio) que hace transitar la cisteína catalítica hacia el sitio activo de adenilación. La alternancia del dominio SCCH se acompaña de una flexión del bucle cruzado entre los residuos Arg615 a Pro623 y una flexión ortogonal del bucle de reentrada entre los residuos Gly888 a Ala893 (Fig. 2a y Fig. 2b complementaria). En la estructura Uba6OPEN/Ub-AMP, la cisteína catalítica se ubica en una hélice corta (H18) dentro del bucle de cruce, mientras que en la estructura Uba6CLOSED/Ub-AMP, H18 se funde en un bucle extendido. Esto orienta la cisteína catalítica para el ataque nucleofílico del enlace glicilo-fosfato de Ub-AMP (Fig. 2a y Fig. 1b complementaria). La ruta alterada del bucle de cruce, que posiciona la cisteína catalítica para la tiolación, se estabiliza mediante la formación de un par de cadenas β cortas (β23–β24) en la estructura Uba6CLOSED/Ub-AMP, mientras que los residuos que comprenden β23-β24 son bucles flexibles en la estructura Uba6OPEN/Ub-AMP (Fig. 2a).

a Comparación del dominio Uba6 SCCH en las conformaciones abierta (adenilación activa) y cerrada (formación activa de enlaces tioéster). Los dominios de adenilación (que sirven como cuerpo rígido de Uba6) se superpusieron y los dominios SCCH se muestran como dibujos animados con las cisteínas catalíticas mostradas como esferas. Se indica el grado de rotación entre cada estado conformacional del dominio SCCH. Para proporcionar un marco de referencia, la posición relativa de la cisteína catalítica en los otros estados conformacionales del dominio SCCH se indica con círculos amarillos semitransparentes y se etiqueta en consecuencia en cada uno de los paneles. Las hélices seleccionadas del dominio SCCH se etiquetan y sus extremos N y C se indican mediante "nt" y "ct", respectivamente. b, c Los elementos de las estructuras Uba6OPEN/Ub-AMP/InsP6 (b, Left, Middle) y Uba6CLOSED/Ub-AMP (c, Left, Middle) que experimentan cambios conformacionales durante la transición de la adenilación a los estados competentes para la tiolación son se muestra como dibujos animados codificados por colores y etiquetados con el resto del complejo mostrado como representación de superficie. Descripción general de los sitios activos Uba6OPEN/Ub-AMP/InsP6 (b, derecha) y Uba6CLOSED/Ub-AMP (c, derecha) con residuos que entran en contacto con el intermedio de adenilato que se muestra como barras. Los enlaces de hidrógeno se muestran como líneas discontinuas y las moléculas de agua seleccionadas se muestran como esferas rojas.

Además de los cambios conformacionales dentro de los bucles de cruce y reentrada de Uba6 que acompañan a la alternancia del dominio SCCH, la tapa cys de Uba6 (residuos 798-817) pasa de un estado ordenado en la estructura Uba6OPEN/Ub-AMP a un estado desordenado en Uba6CLOSED Estructura /Ub-AMP (Fig. 2a). En la estructura Uba6OPEN/Ub-AMP, la tapa cys entierra la cisteína catalítica Uba6 (Fig. 2a, b), lo que puede protegerla del daño oxidativo o químico que reduciría la actividad. En la estructura Uba6CLOSED/Ub-AMP, la alternancia del dominio SCCH hace transitar la tapa de cys muy cerca de la maquinaria catalítica para la adenilación (Fig. 2c y Fig. 1c complementaria). Si la tapa de cys adoptara la misma conformación que en la estructura Uba6OPEN/Ub-AMP, se involucraría en severos choques estéricos. Por lo tanto, el desorden de la tapa de cys durante la tiolación tiene dos propósitos: primero, aumenta la accesibilidad al solvente de la cisteína catalítica, mejorando así su reactividad, y segundo, facilita la alternancia del dominio SCCH al prevenir choques estéricos con el dominio de adenilación en la conformación cerrada. .

Como se señaló anteriormente, el sitio activo de la estructura Uba6OPEN/Ub-AMP representa el producto Ub-adenilato de la reacción de adenilación después de la liberación del grupo saliente PPi y Mg2+. Con respecto al enlace glicil-fosfato entre Ub Gly76 y AMP en el adenilato de Ub, el oxígeno del carbonilo de Gly76 de Ub participa en una red de enlaces de hidrógeno directos y mediados por agua con los nitrógenos de la columna vertebral de Gly469, Ala470, Ile471, Gly472 de Uba6, y el fosfato de AMP (por ejemplo, el fosfato α de ATP) participa en enlaces de hidrógeno directos con Ala470, Arg508 y Gln509 (Fig. 2b). El acoplamiento de ATP·Mg2+ desde la estructura de S. pombe Uba1 (PDB: 4II2) en el sitio activo de Uba6, que se aproxima al complejo de sustrato de la reacción de adenilación, muestra que Arg46 y Arg508 están posicionados para interactuar con el fosfato γ de ATP , Asp569 está posicionado para coordinar un ion Mg2+ conservado, y Asp499, Glu502 y Asn505 están posicionados para participar en la coordinación de un segundo ion Mg2+ (Fig. 2a complementaria). En la estructura Uba6CLOSED/Ub-AMP, el oxígeno del carbonilo de Ub Gly76 participa en la misma red de enlaces de hidrógeno directos y mediados por agua que se observan en la estructura Uba6OPEN/Ub-AMP (Fig. 2c). El fosfato de AMP participa en un enlace de hidrógeno equivalente al nitrógeno de la columna vertebral de Uba6 Ala470 y, como resultado de la alternancia de dominios y la remodelación del sitio activo, ha ganado un nuevo enlace de hidrógeno con Thr626 mientras pierde contactos con Arg508 y Gln509 (Fig. 2c). Por último, se produce una red de enlaces de hidrógeno mediados por agua entre el nitrógeno de la columna vertebral de Gly76, los grupos fosfato y adenina de AMP y Uba6 Asp569, Asn570 y Lys628 que es exclusivo de la estructura Uba6CERRADA/Ub-AMP (Fig. 2c) .

La comparación de la estructura Uba6OPEN/Ub-AMP competente en adenilación con la estructura Uba6CLOSED/Ub-AMP competente en tiolación revela una amplia red de cambios conformacionales dentro del dominio de adenilación que se acoplan con la alternancia del dominio SCCH y sirven colectivamente para remodelar el sitio activo de Uba6 para catalizar la tiolación (Fig. 2b, c y Fig. 2c complementaria). En particular, varios residuos catalíticos clave emanan de regiones que experimentan remodelación durante la transición de los estados competentes de adenilación a tiolación. Esto incluye los aminoácidos 499-599 de la AAD (denominada "región g6" porque alberga la hélice corta 310, g6) y la hélice H1 (residuos 46-51) de la IAD (Fig. 2c y Fig. 2c complementaria) . En la estructura Uba6OPEN/Ub-AMP, la región g6 y H1 interactúan entre sí, lo que ayuda a posicionar adecuadamente los residuos clave para la adenilación y sirve como plataforma para la conformación abierta del dominio SCCH (Fig. 2b). En la estructura Uba6CERRADA/Ub-AMP competente para la tiolación, la región g6 de la AAD se despliega y se aleja del AMP desde el adenilato de Ub, donde interactúa con el dominio SCCH para estabilizar la conformación cerrada, y las hélices H1 y H2 de la IAD sale del sitio activo para evitar conflictos con el dominio SCCH (Fig. 2c y Fig. 2d complementaria). Esto da como resultado el desplazamiento de residuos importantes para la adenilación, incluidos Arg46, Glu502, Asn505, Arg508 y Gln509 del sitio activo, y el reemplazo con residuos importantes para la formación de enlaces tioéster.

En la estructura Uba6CLOSED/Ub-AMP, el carbono β del mutante catalítico de cisteína C625A está a 4,5 Å del carbono del carbonilo Gly76, preparado para el ataque nucleofílico necesario para la tiolación (Fig. 2a, c y Fig. 2c complementaria). Cuando se modela como una cisteína, esta distancia se reduce a ~4 Å y el azufre γ se puede colocar en la posición adecuada para la reactividad con solo un ligero cambio en la ruta del bucle de cruce. Thr626 participa en un enlace de hidrógeno con el fosfato de AMP y Lys628 se involucra en un puente salino con Asp569 del dominio de adenilación (Fig. 2c), que se prevé que coordine Mg2+ durante la catálisis de adenilación (Fig. 2a complementaria). Estos tres residuos (Cys625, Thr626 y Lys628) residen dentro de la hélice H18 en la estructura Uba6OPEN/Ub-AMP, lo que confirma aún más que la fusión de esta hélice en la estructura Uba6CLOSED/Ub-AMP es un aspecto importante de la remodelación del sitio activo que es necesario para el posicionamiento adecuado de estos residuos para la tiolación.

Colectivamente, nuestras estructuras proporcionan los siguientes conocimientos sobre los mecanismos moleculares mediante los cuales Uba6 cataliza la adenilación y la formación de enlaces tioéster. La constelación de aminoácidos dentro del sitio activo en la estructura Uba6OPEN/Ub-AMP sugiere que el carboxilato C-terminal de Ub Gly76 está coordinado para el ataque nucleofílico del fosfato α de ATP durante la catálisis de adenilación a través de enlaces de hidrógeno y complementariedad de carga a través de interacciones con Gly469, Ala470, Ile471, Gly472 en el extremo N-terminal de la hélice Uba6 H14. Aunque el ATP no está presente en nuestra estructura, el modelado sugiere que durante la catálisis de la adenilación, el grupo saliente PPi se estabiliza por los residuos básicos y polares Arg46, Asn505, Arg508, Gln509 y Lys521 (Fig. 2a complementaria). Durante la adenilación, además de estabilizar el fosfato α que se invierte durante el ataque nucleofílico, es probable que el Mg2+ alivie la repulsión electrostática entre el carboxilato Ub Gly76 y el fosfato α del ATP. Después de la liberación del grupo saliente PPi, la alternancia del dominio SCCH y la remodelación del sitio activo desensamblan la maquinaria catalítica para la adenilación y la reorganizan para la tiolación. Esto impulsa la reacción hacia adelante al mismo tiempo que previene la reacción inversa (p. ej., reformación de ATP y Ub libre). En ambas estructuras, el oxígeno del carbonilo α-fosfato y C-terminal de Gly76 de Ub-AMP, que son atacados nucleofílicamente durante la adenilación y la tiolación, respectivamente, apunta directamente hacia el extremo N-terminal de la hélice H14 de Uba6. A su vez, esto sugiere que la electropositividad del dipolo helicoidal puede ayudar a estabilizar la carga negativa del estado de transición y los intermedios tetraédricos formados durante las reacciones de adenilación y tiolación.

Como se señaló anteriormente, en nuestra estructura Uba6OPEN/Ub-AMP de 2,25 Å, observamos una fuerte densidad de electrones dentro de un bolsillo profundo en la superficie del dominio SCCH próximo a H18 y la cisteína catalítica Uba6 (Fig. 3a-e). Según su simetría séxtuple y el entorno químico circundante, identificamos esta densidad como correspondiente a una molécula de InsP6 (Fig. 3d y Fig. 3a complementaria). Dado que esta molécula no estaba incluida ni en la proteína ni en los tampones de cristalización, debe haberse copurificado con la proteína después de la expresión en células de insecto. La densidad electrónica es consistente con la forma más estable de InsP6, myo-InsP6, en la configuración de silla con el fosfato en la posición 2 siendo axial y los fosfatos en las posiciones 1, 3, 4, 5 y 6 siendo ecuatoriales. El análisis de la estructura muestra que la molécula InsP6 se ​​une a un bolsillo muy básico dentro del núcleo globular del dominio SCCH que se conserva casi por completo desde el pez cebra hasta los humanos (tenga en cuenta que Uba6 es específico de vertebrados y erizos de mar) (Fig. 3f). El fosfato axial de InsP6 participa en una red de enlaces de hidrógeno con Lys644, Lys706, Lys709 y Tyr710, mientras que los fosfatos ecuatoriales entran en contacto con Ser647, Lys652, Lys687, Arg691 y Lys714, con Trp640 desempeñando un papel estructural en la organización del bolsillo de unión ( Fig. 3a, d).

a–c Representaciones electrostáticas superficiales de los dominios SCCH de estructuras humanas Uba6 abiertas (a), Uba6 cerradas (b) y Uba1 (c). Los residuos de Uba6 implicados en los contactos con InsP6 en la estructura abierta de Uba6 y los residuos correspondientes de las estructuras Uba6 cerrada y Uba1 están marcados. La tapa de cys ordenada en la estructura abierta de Uba6 se muestra como caricatura y color cian y las tapas de cys desordenadas de Uba6 cerrada y Uba1 se muestran como círculos cian discontinuos. d El mapa de densidad de omisión compuesto (contorneado en 1σ) para InsP6 en la estructura abierta Uba6 se muestra como una malla azul. InsP6 se ​​muestra como barras con carbonos (verde), oxígenos (rojo), fosfatos (naranja). Los residuos que interactúan con InsP6 se ​​muestran como barras y los enlaces de hidrógeno se muestran como líneas discontinuas. El mapa de densidad de omisión compuesto para el bolsillo de unión de InsP6 en la estructura cerrada de Uba6 se muestra como en d. InsP6 ha sido modelado en base a la estructura abierta Uba6. f Alineación de secuencia basada en la estructura de la región de unión de InsP6 en el dominio Uba6 y Uba1 SCCH. La estructura secundaria para Uba6 se muestra arriba. Los residuos importantes para la unión de InsP6 están resaltados con estrellas amarillas. g Datos de calorimetría de titulación isotérmica para interacciones entre las variantes Uba6 y Uba1 indicadas con el fosfato de inositol indicado. Los experimentos se realizaron por triplicado y los paneles superiores muestran datos de potencia sin procesar y los paneles inferiores muestran ajustes de los datos a ecuaciones de unión estándar utilizando el software NanoAnalyze (instrumentos TA). A lo largo de la figura, las etiquetas "Apo" se refieren al material derivado de E. coli.

Curiosamente, la tapa de cys y el bucle cruzado de Uba6 albergan residuos que participan en una gran red de contactos con InsP6, fuera del bolsillo básico en el dominio SCCH globular (Fig. 3a, d). La tapa cys cubre la molécula InsP6 y contribuye con dos residuos básicos, Lys800 y Lys810, que participan en contactos directos y mediados por agua con tres fosfatos ecuatoriales de InsP6 (Fig. 3a, d). Además, Lys628, que se encuentra cerca de la cisteína catalítica en la hélice H18 dentro del bucle cruzado de Uba6, también contacta con dos fosfatos ecuatoriales de InsP6. En particular, la red de contactos entre la tapa de cys, el bucle de cruce e InsP6 no puede tener lugar en la estructura Uba6CLOSED/Ub-AMP, ya que la tapa de cys se desordena y el bucle de cruce toma una ruta drásticamente diferente durante la alternancia del dominio SCCH y activa. remodelación del sitio que acompaña a la tiolación (Fig. 2a, c). De acuerdo con esto, observamos solo una densidad de electrones débil correspondiente a los fosfatos axiales y ecuatoriales de InsP6 en la estructura Uba6CLOSED/Ub-AMP, por lo que InsP6 no se incluyó en el modelo final (Fig. 3e). El acoplamiento de InsP6 en el dominio SCCH de la estructura Uba6CLOSED/Ub-AMP muestra que no hay choques estéricos importantes con Uba6 (Fig. 3b complementaria), lo que, junto con los datos anteriores, sugiere un sitio de unión de baja afinidad para InsP6 en la conformación cerrada .

Mientras que los residuos involucrados en los contactos con InsP6 en la estructura Uba6OPEN/Ub-AMP exhiben una identidad del 92 al 100 % de los erizos de mar con los humanos, la misma comparación revela que Uba1 exhibe solo una identidad del 8 al 25 % con el Uba6 humano en esta región con muchos de ellos. las diferencias involucran residuos cargados (Fig. 3f). En consecuencia, la región equivalente en Uba1 tiene características estructurales y electrostática superficial marcadamente diferentes en comparación con Uba6 (Fig. 3c). Esto sugiere que la capacidad de interactuar con InsP6 ha evolucionado como una característica específica de Uba6 pero no de Uba1. Para probar esta hipótesis, purificamos Uba6 y Uba1 usando E. coli y medimos las afinidades por InsP6 usando calorimetría de titulación isotérmica (ITC). Se usó E. coli porque este organismo no produce fosfatos de inositol ni fosfolípidos de inositol y, por lo tanto, InsP6 no se copurificaría con las proteínas. Los resultados muestran que mientras Uba6 derivado de bacterias se une a InsP6 con una KD de ~ 41 nM, Uba1 no muestra una unión detectable en las mismas condiciones (Fig. 3g). También probamos la capacidad de Uba6 para unirse a los fosfatos de inositol de señalización InsP3 (D-mio-inositol 1,4,5-trifosfato) e InsP5 (D-mio-inositol 1,3,4,5,6-pentakisfosfato), que son ambos precursores de InsP6, y descubrieron que también podían interactuar con Uba6, aunque con valores de KD más altos de 248 y 73 nM, respectivamente (Fig. 3g). Esto es consistente con InsP3 e InsP5, cada uno de los cuales carece del fosfato axial que es importante para la unión de InsP6. Es importante destacar que la mutación de los residuos de Uba6 que comprenden el bolsillo de unión de InsP6 de Uba6 a los aminoácidos correspondientes de Uba1 (K644E/S648L/L702W/K706H/K709T/Y710Q; en lo sucesivo denominado Uba6_InsP6mut) anula por completo la interacción entre Uba6 e InsP6 según lo evaluado usando ITC (Fig. 3g y Fig. 3c complementaria). En conjunto, estos resultados indican que la unión de InsP6 es una característica específica de Uba6 y no de Uba1 y que el bolsillo de unión básico de Uba6 también es capaz de unirse a otros fosfatos de inositol de señalización, como InsP3 e InsP5. Por último, la alta afinidad de Uba6 por InsP6 (~41 nM), junto con las concentraciones intracelulares de InsP6 en células eucariotas en el rango de 10 a 100 μM43,44, sugiere que esta unión tiene importancia fisiológica. También proporciona una explicación para la robusta copurificación de InsP6 con Uba6 expresada en células de insecto, incluso después de varios pasos de purificación.

A continuación, examinamos si InsP6 es capaz de modular la actividad de Uba6 mediante la determinación de parámetros cinéticos de estado preestablecido para la formación de enlaces tioéster Uba6 ~ Ub y Uba6 ~ FAT10 en presencia y ausencia de InsP6 50 μM. Se seleccionó esta concentración porque es la concentración celular mediana reportada en la literatura. En estos ensayos se usó Uba6 derivado de E. coli ya que, como se indicó anteriormente, E. coli no puede sintetizar InsP6. Curiosamente, descubrimos que, si bien la constante de Michaelis (Km) es aproximadamente la misma para Ub y FAT10 en presencia y ausencia de InsP6, la constante de velocidad observada (kobs) de la formación intermedia de tioéster Uba6~Ub y Uba6~FAT10 es ~3 -4 veces más lento en presencia de InsP6 (Fig. 4a, b; Tabla 1; y Figs. complementarias 4–6). En particular, los parámetros cinéticos para el Uba6 derivado de células de insecto son similares al material derivado de E. coli en presencia de InsP6, lo que indica que el InsP6 copurificado en el material derivado de células de insecto atenúa de manera similar la actividad catalítica (Fig. 4a, b y Tabla 1).

a, b Curvas cinéticas de Uba6 derivado de E. coli en presencia y ausencia de InsP6, y Uba6 derivado de células de insecto, en ensayos de actividad de tioéster Uba6~Ubl. A lo largo de la figura, las etiquetas "Apo" se refieren al material derivado de E. coli. Los datos se presentan como valores medios +/− SEM (n = 3 repeticiones técnicas). c Curvas IC50 para la inhibición de InsP6 de las actividades de formación de tioéster Ub (izquierda) y FAT10 (derecha) de las variantes Uba6 y Uba1 indicadas. Los datos se presentan como valores medios +/− SEM (n = 3 repeticiones técnicas). d Efectos de InsP6 y otros polifosfatos de inositol sobre las actividades de formación de tioéster Uba6~Ub (arriba) y Uba6~FAT10 (abajo) de las variantes de Uba6 indicadas. Los ensayos se realizaron en presencia y ausencia de InsPx(3, 5 o 6) 100 µM. Los datos se presentan como valores medios +/− SEM (n = 3 repeticiones técnicas) y se muestran como porcentajes del valor WT con repeticiones individuales que se muestran como círculos grises. e Temperaturas de fusión de las variantes del dominio SCCH indicadas determinadas por ensayos de desplazamiento térmico en presencia y ausencia de InsPx(3, 5 o 6) 100 μM. Los datos se presentan como valores medios +/− SEM (n = 3 repeticiones técnicas) con repeticiones individuales que se muestran como círculos grises. Los datos de origen subyacentes a la Fig. 4a–e se proporcionan como un archivo de datos de origen.

Para evaluar aún más los efectos de InsP6 en la actividad de E1, se realizaron experimentos de dosis-respuesta utilizando ensayos de formación de tioéster E1~Ub y E1~FAT10 utilizando Uba6_WT, Uba6_InsP6mut y Uba1_WT producidos en E. coli con concentraciones de InsP6 que oscilan entre 0 y 50 μM. Los resultados muestran que InsP6 inhibe Uba6~Ub y Uba6~FAT10 con valores IC50 de 51 y 67 nM (Fig. 4c y Fig. 7a complementaria), respectivamente, de acuerdo con la KD de la interacción Uba6/InsP6 medida con ITC (41 nM ). Es importante destacar que InsP6 no pudo inhibir la activación de Uba6_InsP6mut tanto de Ub como de FAT10, e InsP6 no pudo inhibir la activación de Uba1 de Ub (Fig. 4c). Estos resultados demuestran además que el efecto inhibidor de InsP6 es específico de Uba6 y está mediado por la unión al bolsillo básico en su dominio SCCH. También probamos la capacidad de InsP3 e InsP5 para inhibir la activación de Uba6 de Ub y FAT10 utilizando ensayos de formación de tioéster E1 ~ Ub / FAT10 (Fig. 4d y Fig. 7b complementaria). Estos fosfatos de inositol exhiben una inhibición significativamente menor de la formación del intermedio de tioéster Uba6~Ub y Uba6~FAT10 en relación con InsP6 (Fig. 4d), lo cual fue sorprendente dado que tanto InsP3 como InsP5 se unen a Uba6 con alta afinidad (valores KD de 248 y 73 nM , respectivamente, Fig. 3g). Este resultado indica un papel importante para el fosfato axial de InsP6 en la modulación de la actividad de Uba6.

A continuación, se realizaron ensayos de cambio térmico para determinar si la unión de fosfato de inositol afecta la estabilidad de Uba6 utilizando variantes de Uba6 de dominio SCCH de longitud completa e independientes (Fig. 4e y Fig. 8 complementaria). Los resultados indican que la unión de InsP6 al dominio Uba6 SCCH derivado de E. coli aumenta su temperatura de fusión de ~43 a 59 °C, que es similar a la temperatura de fusión de la proteína derivada de células de insectos (Fig. 4e). InsP3 e InsP5 aumentan la temperatura de fusión del dominio Uba6 SCCH derivado de E. coli de ~43 a 47 y 54 °C, respectivamente, mientras que ninguno de los fosfatos de inositol afecta la estabilidad de la proteína derivada de células de insectos (Fig. 4e). Por último, ninguno de los fosfatos de inositol afectó la estabilidad térmica del dominio Uba6_InsP6mut SCCH derivado de E. coli (Fig. 4e), lo que nuevamente demuestra que la actividad moduladora de los fosfatos de inositol en Uba6 está mediada por la unión al bolsillo básico del dominio SCCH . Aunque las curvas de fusión son más complicadas debido a la naturaleza multidominio de Uba6, las tendencias descritas anteriormente para el dominio Uba6 SCCH son similares en el contexto de Uba6 de longitud completa (Fig. 8 complementaria).

El análisis de nuestras estructuras Uba6OPEN/Ub-AMP y Uba6CLOSED/Ub-AMP proporciona información sobre el mecanismo molecular mediante el cual la unión de InsP6 a Uba6 modula su actividad y estabilidad. Como se señaló anteriormente, muchos de los residuos que interactúan con InsP6 en la estructura Uba6OPEN/Ub-AMP están ubicados dentro de regiones de Uba6 que deben desordenarse (cys cap), adoptar conformaciones significativamente diferentes (bucle cruzado y H18) u ocupar ubicaciones significativamente diferentes. debido a la alternancia del dominio SCCH durante la transición a la conformación cerrada para la catálisis de la formación de enlaces tioéster (Fig. 2a-c). Esto incluye Lys628 del bucle cruzado, Lys714 del dominio SCCH y Lys800 y Lys810 del cys cap, que juntos participan en una extensa red de enlaces de hidrógeno y puentes salinos con fosfatos ecuatoriales de InsP6 en la estructura Uba6OPEN/Ub-AMP ( Figura 5a, b). En la estructura Uba6CLOSED/Ub-AMP, todos estos contactos con InsP6 se ​​pierden y, en cambio, Lys628 y Lys714 participan en puentes salinos con Asp569 y Glu502 dentro del sitio activo que contribuyen a la estabilización de la conformación cerrada (Fig. 5a, b).

a, b Las estructuras Uba6 abierta (a) y Uba6 cerrada (b) se muestran como representaciones de superficie excepto los dominios SCCH, que se muestran como bucles. Los elementos que experimentan cambios conformacionales en el dominio SCCH durante la transición del estado de adenilación al competente en tiolación se muestran como dibujos animados. Los aminoácidos seleccionados se muestran como esferas. InsP6 y AMP se muestran como barras. La tapa de cys desordenada se muestra como círculos cian. c Dominio SCCH de la estructura abierta Uba6 modelada en la conformación cerrada. SCCH abierto (que se muestra como bucles), se superpuso al dominio SCCH de la estructura cerrada de Uba6 con Uba6 como representación de superficie. El choque estérico entre elementos de SCCH [abierto], incluidos cys cap, Helix 18, crossover loop y reentry loop con Uba6, se resalta mediante rectángulos rojos discontinuos. d Análisis de estructura-función de las cadenas laterales de Uba6 representadas en a y b en ensayos de entrecruzamiento de Ub-AVSN que desacoplan la adenilación y la tiolación y evalúan específicamente la actividad de tiolación (izquierda). A lo largo de la figura, "Apo" se refiere a material derivado de E. coli. Esquema de Ub-AVSN y el entrecruzamiento Uba6-Ub-AVSN (derecha). El centro electrofílico atacado durante la reacción con Uba6 está indicado por una estrella negra. Los datos se presentan como valores medios +/− SEM (n = 3 repeticiones técnicas) y se muestran como porcentajes del valor WT con repeticiones individuales que se muestran como círculos grises. e Análisis de estructura y función de las cadenas laterales de Uba6 representadas en ayb en ensayos de tiolación de Uba6~Ub que requieren tanto adenilación como tiolación. Los datos se presentan como valores medios +/− SEM (n = 3 repeticiones técnicas) y se muestran como porcentajes del valor WT con repeticiones individuales que se muestran como círculos grises. Los datos de origen subyacentes a la Fig. 5d, e se proporcionan como un archivo de datos de origen.

Esto lleva a la hipótesis de que la unión de InsP6 a Uba6 inhibe su actividad al estabilizar la conformación abierta de Uba6, lo que dificulta la formación de la conformación cerrada necesaria para la tiolación. Esto ocurre a través de la estabilización mediada por InsP6 de la tapa cys que cubre la cisteína catalítica y chocaría con el dominio de adenilación si permaneciera ordenado en la conformación cerrada (Fig. 5c), y la estabilización del bucle cruzado (incluida la cisteína catalítica que contiene H18) en una conformación en la que la cisteína catalítica está distante del sitio activo. De acuerdo con esta hipótesis, encontramos que la actividad moduladora de InsP6 disminuye significativamente en los mutantes K628A y K714D de Uba6 tanto en los ensayos de actividad de formación de tioéster Uba6~Ub como en los ensayos de reticulación Uba6-Ub-AVSN (Fig. 5d y Fig. 9a complementaria). , b). Ub-AVSN45,46 alberga una sulfonamida de vinilo electrófila diseñada para eludir la semirreacción de adenilación, lo que sirve específicamente como lectura de la semirreacción de tiolación al atrapar covalentemente el nucleófilo de cisteína E1 entrante25,31. Además, la KD de la interacción K714D Uba6/InsP6 aumentó ~30 veces (de 41 nM a 1,45 μM) (Fig. 9c complementaria), en línea con la pérdida de enlaces de hidrógeno con el fosfato 6' y las interacciones electrostáticas de largo alcance con el fosfato 5' de InsP6. También de acuerdo con nuestra hipótesis, tanto los mutantes E502A como los D569A exhiben una actividad severamente disminuida tanto en la formación de tioéster Uba6 ~ Ub como en los ensayos de reticulación Uba6-Ub-AVSN (Fig. 5d).

En conjunto, nuestros datos sugieren que InsP6 media: (1) la estabilización de los bucles flexibles dentro del dominio SCCH (cy cap, crossover loop), (2) la estabilización del dominio SCCH en la conformación abierta y, por extensión, la rigidez de H1/H2, y elementos estructurales g6 dentro del sitio activo, y (3) estabilización del propio dominio SCCH globular al unir los dos lóbulos del dominio (Fig. 3a). Esto nos lleva a plantear la hipótesis de que estas características contribuyen colectivamente al aumento significativo en la estabilidad térmica del complejo Uba6 / InsP6 en comparación con Uba6 solo (Fig. 4e y Fig. 8 complementaria). De hecho, esto puede explicar el rendimiento significativamente mayor de Uba6 recombinante cuando se expresa en células de insecto en comparación con la expresión en E. coli.

En este manuscrito, presentamos instantáneas estructurales de Uba6, que juntas revelan los mecanismos moleculares por los cuales esta enzima cataliza la adenilación y la tiolación. La estructura Uba6OPEN/Ub-AMP representa el complejo producto de la adenilación después de la liberación de PPi/Mg2+ y la estructura Uba6CLOSED/Ub-AMP representa el complejo preparado para la catálisis de la tiolación. Una comparación de las estructuras abiertas y cerradas revela que la alternancia del dominio SCCH y la remodelación del sitio activo desensamblan el sitio activo de adenilación y lo reconfiguran para la reacción de tiolación intercambiando residuos importantes para la catálisis en el sitio activo. La hélice H14 de Uba6 se coloca para constituir el agujero de oxianión del sitio activo al proporcionar un potencial electrostático positivo complementario para la estabilización del estado de transición y el intermedio tetraédrico formado durante la adenilación y la formación del enlace tioéster.

Si bien muchas de las características mecanísticas destacadas de la catálisis de la adenilación y la tiolación se conservan con otras E1 como Uba125 y la E1 para SUMO31, nuestras estructuras de Uba6 revelan una característica única e inesperada de Uba6; es decir, el bolsillo altamente básico en el dominio SCCH que se une a InsP6 y sirve para modular tanto la actividad como la estabilidad de la enzima. La proximidad del sitio de unión de InsP6 a los elementos estructurales que juegan un papel clave en la alternancia del dominio SCCH y la remodelación del sitio activo proporciona una explicación de cómo InsP6 modula la actividad de Uba6. Nuestros datos sugieren que la reducción mediada por InsP6 en la actividad de Uba6 se debe a la estabilización de los elementos estructurales que experimentan cambios conformacionales durante la transición del estado competente de adenilación al competente de tiolación. Curiosamente, nuestros datos sugieren que estas interacciones contribuyen a la estabilidad térmica de Uba6 a través de los mismos mecanismos. Nuestros hallazgos son similares a los de un inhibidor alostérico de SUMO E1 llamado COH00032. Aunque su sitio de unión es totalmente diferente en comparación con InsP6, COH000 también se une a un bolsillo que está cerca de elementos estructurales clave para la alternancia del dominio SCCH y la remodelación del sitio activo y explota estas características mecánicas como parte de su mecanismo inhibitorio32. El descubrimiento de COH000 llevó a la especulación de que las enzimas E1 podrían estar reguladas alostéricamente por metabolitos celulares naturales y, de hecho, InsP6 es el primer ejemplo de este tipo.

En particular, nuestros datos demuestran que Uba6 también puede unirse a otros fosfatos de inositol. Estos incluyen los segundos mensajeros InsP3 e InsP5, que se unen con afinidad nanomolar, aunque no inhiben la actividad de Uba6 en la medida en que InsP6 (Fig. 3g). Por el contrario, el mioinositol (que carece de fosfatos) no se une a Uba6 con afinidad detectable. En principio, se pueden generar más de 63 InsP fosforilados mediante la fosforilación secuencial de mioinositol, y queda por ver cómo la increíble complejidad en la diversidad de fosfatos de inositol podría interactuar con la función Uba647,48. En comparación con Uba6, Uba1 tiene una estructura y una distribución de carga superficial totalmente diferentes en la región correspondiente al sitio de unión del polifosfato de inositol de Uba6 y no interactúa de manera detectable con los polifosfatos de inositol (Fig. 3g). Es intrigante especular que la capacidad única de Uba6 para interactuar con los polifosfatos de inositol puede ser la base de la observación de que solo la mitad de las moléculas Uba6 presentes en cualquier momento en la célula se activan con Ub/FAT10, en comparación con casi todas las moléculas Uba1 existentes en el activado. estado6,33. El número de enzimas involucradas en la señalización de Ub/FAT10 que se ha demostrado que interactúan y/o son reguladas por fosfatos de inositol está en constante crecimiento, y los primeros ejemplos demostrados son la regulación de InsP5 e InsP6 de la función de la ligasa cullin-RING E3 Ub en plantas y humanos36, 37,38,39. Esto sugiere que puede haber un subconjunto de ejes de señalización Ub/FAT10 que están regulados por fosfatos de inositol que gobiernan distintos procesos celulares. Desde una perspectiva más amplia, la vía Ub/FAT10 es una de varias vías de señalización que ahora se sabe que están reguladas por interacciones de alta afinidad con segundos mensajeros del fosfato de inositol y sugiere que apenas estamos comenzando a comprender el papel que desempeñan estas moléculas en la biología celular49 ,50.

Por último, es intrigante especular que otros metabolitos o macromoléculas celulares cargados negativamente pueden comprometer el bolsillo de unión básico de Uba6 en ciertos contextos celulares.

Por ejemplo, las fosfoinosítidas, que albergan una variedad de grupos de cabeza de inositol fosforilados, interactúan con una variedad de proteínas celulares de manera regulada. Estos grupos de cabeza de inositol fosforilados sirven como precursores de fosfatos de inositol solubles como InsP3, InsP4, InsP5, InsP6 que hemos demostrado que se unen a Uba6 con alta afinidad. Esto sugiere que Uba6 podría ser capaz de interactuar con ciertos fosfoinosítidos, lo que, además de regular su actividad y estabilidad, podría servir como mecanismo para alterar su localización subcelular. En este sentido, cabe destacar que se han informado funciones tanto para Uba6 como para fosfoinosítidos en la autofagia51,52. Asimismo, este estudio refuerza la posibilidad de que otros E1 puedan unirse a otros metabolitos celulares naturales como mecanismo de regulación. En consonancia con esto, previamente identificamos un pequeño bolsillo en la superficie del dominio SCCH de Uba1 que se prevé que sea un punto de acceso de unión a ligando (punto de acceso 3)23. La estructura y la electrostática del Hotspot 3 en Uba1 difieren del sitio de unión de InsP6 de Uba6 (Fig. 3a-c) y, por lo tanto, cualquier unión de metabolitos o macromoléculas en esta ubicación poseería propiedades estructurales y fisicoquímicas diferentes en comparación con los fosfatos de inositol.

Si bien nuestro trabajo ha aclarado los mecanismos moleculares por los que Uba6 cataliza la adenilación y la tiolación, y también ha revelado inesperadamente un mecanismo regulador mediado por un metabolito celular, queda mucho por aprender sobre esta enzima. Esto incluye dilucidar qué papel juega la unión del fosfato de inositol en la regulación de la función de Uba6 en las células, y si otros factores celulares también se unen al bolsillo básico en el dominio SCCH para modular su actividad. Las preguntas adicionales incluyen definir las reglas moleculares que rigen la doble especificidad de Uba6 para Ub y FAT10, y dilucidar el mecanismo para la transferencia de estos Ub/Ubls a la enzima de conjugación Uba6 E2 cognada Ube2Z. En este sentido, el sitio de unión de InsP6 de Uba6 se superpone con la superficie de unión de E2 predicha de su dominio SCCH y será emocionante determinar si InsP6 juega algún papel en la transtioesterificación de E1-E2-Ub. Por último, nuestras estructuras Uba6/Ub-AMP y, en particular, las diferencias con el sitio activo Uba1 humano, proporcionarán un marco para los esfuerzos de descubrimiento de fármacos dirigidos específicamente a esta enzima para la intervención terapéutica en el cáncer y otras enfermedades.

Para la expresión de E. coli, el fragmento de ADN que codifica los residuos Uba6 humanos 37–1052 se clonó en sitios NdeI/NotI del vector pSMT3.2 con una etiqueta SMT3 escindible con ULP1 N-terminal53. El fragmento de ADN que codifica el dominio Uba6 SCCH humano (residuos 615–892) o el dominio Uba1 SCCH humano (residuos 625–892) se sintetizó (Gene Universal) y se insertó en los sitios NdeI/NotI del vector pSMT3.4 con un N-terminal ULP1- etiqueta SMT3 escindible. El fragmento de ADN que codifica la ubiquitina humana se insertó en los sitios NcoI/XhoI del vector pET29NTEV con una etiqueta 6 × His N-terminal escindible con TEV. El fragmento de ADN que codifica la FAT10 humana (C7T/C9T/C134L/C160S/C162S)40 se sintetizó y se insertó en los sitios BamHI/NotI del vector pGEX-6P1. La ubiquitina de trigo con sus siete lisinas mutadas a arginina (UbK7R) se preparó como se describió previamente54. Para la expresión de células de insectos, el fragmento de ADN que codifica los residuos Uba6 humanos 37–1052 se clonó en sitios NcoI/NotI de pFastBac HTB con una etiqueta 6x His N-terminal TEV escindible. La cisteína catalítica, Cys625, se mutó a alanina para la cristalización. El fragmento de ADN que codifica el dominio Uba6 SCCH humano (residuos 615–892) se clonó en sitios BamH/NotI de pFastBac HTB con una etiqueta 6x His N-terminal TEV escindible. Todas las mutaciones puntuales se introdujeron mediante mutagénesis dirigida al sitio basada en PCR. Todas las construcciones y mutaciones puntuales se generaron utilizando los pares de cebadores descritos en la Tabla complementaria 2.

Todas las proteínas expresadas en células E. coli BL21 (DE3) Codon Plus (Agilent; Cat. No. 230280) se produjeron como se describió anteriormente23. Brevemente, los cultivos a gran escala se cultivaron a 37 °C en medio Luria Broth hasta A600 OD 2,0 y luego se colocaron en un baño de hielo para un choque frío con la adición de etanol al 1,5 % (v/v). Después de 30 min, la proteína se indujo mediante la adición de isopropil-β-d-1-tioglactiósido (IPTG) hasta una concentración final de 0,1 mM seguido de agitación a 18 °C durante la noche. Se usó el sistema de expresión de baculovirus Bac-to-Bac para expresar Uba6 humano en células de insecto. Se usaron baculovirus recombinantes de alto título para infectar células BTI-Tn-5B1–4 (Hi5) (ThermoFisher Scientific; Cat. No. B85502) a una densidad celular de 2 × 106 células/ml cultivadas en medio Sf-900 II SFM (ThermoFisher Scientific; Cat. No. B85502) Científico). Las células se recolectaron después de 48 h de infección y se almacenaron a -80 °C antes de su uso posterior.

Se recolectaron células Uba6 expresadas en células bacterianas o de insectos mediante centrifugación y lisadas mediante sonicación en tampón de lisis (Tris HCl 20 mM pH 8,0, NaCl 350 mM, imidazol 20 mM, TCEP 0,5 mM), en presencia de ADNasa y lisozima. El lisado celular se centrifugó a 39.191 × g durante 30 min y el sobrenadante se aplicó a resina Ni-NTA (QIAGEN), y la proteína se eluyó en tampón Tris HCl 20 mM pH 8,0, NaCl 350 mM, imidazol 250 mM, 0,5 mM TCEP. La etiqueta SMT3 se escindió añadiendo proteasa ULP1 en una proporción de 1:2000 (p/p) e incubando durante la noche a 4 °C. La etiqueta 6x His se escindió añadiendo proteasa TEV en una proporción de 1:100 (p/p) e incubando durante la noche a 4 °C. Después de la escisión, la proteína se sometió a filtración en gel Superdex 200 (GE Healthcare) con tampón Tris HCl 20 mM pH 8,0, NaCl 350 mM, TCEP 0,5 mM y, posteriormente, la proteína objetivo se combinó y se sometió a la columna de intercambio aniónico MonoQ (GE Healthcare ) con tampón (tampón A: Tris HCl 20 mM pH 8,0, NaCl 50 mM, TCEP 0,1 mM; tampón B: Tris HCl 20 mM pH 8,0, NaCl 1000 mM, TCEP 0,1 mM) para purificación adicional. El dominio Uba6 SCCH y el dominio Uba1 SCCH se purificaron como se describe para Uba6, excepto por el uso de una columna Superdex 75 (GE Healthcare) en lugar de Superdex 200. FAT10 se purificó mediante cromatografía de afinidad GST y filtración en gel Superdex 75 (GE Healthcare). La ubiquitina humana y el UbK7R de trigo se purificaron por afinidad Ni-NTA y filtración en gel Superdex 75 (GE Healthcare). Después de la purificación, las proteínas se concentraron a 5–10 mg/ml, se dividieron en alícuotas y se congelaron instantáneamente en nitrógeno líquido.

Uba6 C625A se purificó como se describe anteriormente a una concentración final de 115 μM en Tris HCl 20 mM, pH 8,0, NaCl 150 mM, TCEP 0,5 mM. Se añadieron UbK7R de trigo (230 μM), MgCl2 (5 mM) y ATP (1 mM) antes del cribado de matriz dispersa en Intelli-Plate (Art Robbins Instruments) a 18 °C. Se cultivaron cristales de calidad de difracción del complejo Uba6/Ub mezclando 1 μl de muestra de proteína con 1 μl de tampón de cristalización (MES 100 mM pH 6,4, NaF 140 mM, PEG3350 al 15 %). Los cristales se congelaron instantáneamente en nitrógeno líquido en un crioprotector compuesto de licor madre suplementado con 30 % de PEG3350.

Se recopiló un conjunto completo de datos de difracción de rayos X de un solo cristal Uba6/Ub a una resolución de 2,25 Å en la fuente de fotones avanzada (Argonne, IL), línea de luz NE-CAT 22-ID-E. Todos los datos se indexaron, integraron y escalaron utilizando HKL200055. Los cristales pertenecen al grupo espacial C2 con dimensiones de celda unitaria a = 248,6 Å, b = 101,3 Å, c = 122,9 Å y α = 90°, β = 118°, γ = 90°, con dos complejos hUba6/Ub por núcleo asimétrico. unidad.

Se utilizó el programa Sculptor para generar un modelo de Uba6 humano basado en las coordenadas de H. sapiens Uba1 (PDB: 6DC6)23. Luego se usó el programa PHASER56 para encontrar una solución de reemplazo molecular usando las coordenadas de los dominios individuales (dominios AAD/IAD, FCCH, SCCH y UFD) del modelo Uba6 Sculptor y trigo Ub (PDB: 4II2). El modelo se refinó a valores R/Rfree de 0,166/0,206 mediante rondas iterativas de refinamiento y reconstrucción utilizando PHENIX57 y COOT58. La ronda inicial de refinamiento involucró el ajuste de cuerpo rígido de AAD/IAD, FCCH, SCCH y UFD de hUba6 y Ub. Después de la ronda inicial de refinamiento, la densidad de electrones fuerte y continua en los terminales C de ambas moléculas de Ub en la AU fue consistente con el producto de adenilato de Ub, y el AMP y el enlace glicilfosfato se incorporaron posteriormente a la densidad de electrones después de varios cambios adicionales. rondas de construcción y refinamiento de modelos. En la estructura Uba6OPEN/Ub-AMP, también observamos una fuerte densidad de electrones dentro de un bolsillo en el dominio SCCH que asignamos como una molécula InsP6 en función de la simetría de seis veces de la densidad y el entorno químico circundante. Colocamos manualmente un InsP6 en la densidad durante las rondas finales de refinamiento, que refinó bien. En la estructura Uba6CERRADA/Ub-AMP, con la excepción de la posición correspondiente al fosfato axial de InsP6, la densidad de electrones para InsP6 es significativamente más débil y, por lo tanto, InsP6 no se modeló.

El modelo final de hUba6/Ub-AMP contiene los aminoácidos 1 a 76 de ambas copias de Ub (cadenas B y D), los aminoácidos 40 a 1050 de la copia A de Uba6 y los aminoácidos 59 a 798 y 819 a 1049 de la copia C de Uba6. El modelo contiene dos moléculas de AMP de los intermedios Ub-AMP de la cadena B y D, una molécula de InsP6 asociada con la cadena A de Uba6 y 846 moléculas de agua. El modelo final tiene una buena geometría, con 97,1, 2,7 y 0,2 % de residuos en las regiones favorecidas, permitidas y no permitidas del espacio de Ramachandran, respectivamente. Todas las representaciones gráficas moleculares de las estructuras se generaron utilizando PyMOL59. Las alineaciones de la estructura se realizaron utilizando el programa Superpose en el paquete de software CCP460.

Los experimentos ITC se realizaron en un Affinity ITC (instrumentos TA) a 25 °C en tampón que contenía HEPES 20 mM pH 7,5, NaCl 150 mM, TCEP 0,5 mM. Alícuotas (2,5 μl cada una) de InsP3 100 μM (D-mio-inositol 1,4,5-trifosfato triamonio sal, Santa Cruz), InsP5 (D-mio-inositol 1,3,4,5,6-pentakisfosfato sal de pentapotasio , Enzo) o InsP6 (hidrato de sal sódica del ácido fítico, Sigma-Aldrich) en una célula que contenía un dominio SCCH o de longitud completa 10 μM de proteínas E1 o Ubl. Se realizaron veinte mediciones y los datos se analizaron utilizando NanoAnalyze (instrumentos TA). Cada experimento se realizó por triplicado.

Los ensayos de formación de tioéster E1 basados ​​en gel se realizaron con E1 100 nM, Ubl 2,5 μM, MgCl2 5 mM, ATP 500 μM, NaCl 137 mM, KCl 2,7 mM, Na2HPO4 10 mM, KH2PO4 1,8 mM pH 7,4, glicerol al 5% y glicerol 0,1 mM. TCEP a temperatura ambiente (RT). Las reacciones se iniciaron agregando ATP y se terminaron agregando tampón SDS-PAGE de urea no reductora y se sometieron a gel NuPAGE Bis-Tris al 4–12 % (Life Technologies), 150 V constante durante 60 min. Los geles se tiñeron con Sypro Ruby (BioRad) y se visualizaron con un ChemiDoc MP (BioRad). La cuantificación de datos se realizó mediante densitometría en el software ImageJ 1.53 y se analizó mediante Prism 7.0a (GraphPad). Las medidas de densitometría se normalizaron como un porcentaje del ensayo WT de control en el mismo gel. Los datos se representan como un promedio de tres repeticiones técnicas con barras de error de desviación estándar. Las imágenes sin procesar de geles representativos para todos los ensayos bioquímicos se proporcionan en el archivo de datos de origen.

Todos los ensayos de inhibición de E1~Ubl se realizaron incubando 100 nM del E1 indicado con InsPx 100 μM (IP3, IP5 o IP6) en un tampón que contenía NaCl 137 mM, KCl 2,7 mM, Na2HPO4 10 mM, KH2PO4 1,8 mM, pH 7,4, y MgCl2 5 mM durante 5 min a temperatura ambiente. Posteriormente se añadieron ATP y la Ubl correspondiente hasta una concentración final de 500 y 2,5 μM, respectivamente. Las reacciones se incubaron a TA durante 2 sy se terminaron usando tampón SDS-PAGE de urea no reductora. Todas las muestras se sometieron a SDS-PAGE, se tiñeron, visualizaron y cuantificaron como se describe anteriormente para los ensayos de activación de E1~Ubl, excepto que las medidas de densitometría se normalizaron como un porcentaje del control WT sin el ensayo InsPx en el mismo gel.

El entrecruzamiento de construcciones mutantes y de tipo salvaje de E1 a Ub-AVSN se realizó en una mezcla de reacción que contenía E1 100 nM, Ub-AVSN 500 nM, NaCl 137 mM, KCl 2,7 mM, Na2HPO4 10 mM, KH2PO4 1,8 mM pH 7,4, 5 % de glicerol y TCEP 0,5 mM a TA durante 1 min y desnaturalizado en tampón SDS-PAGE reductor. Las muestras se sometieron a SDS-PAGE, se tiñeron, visualizaron y cuantificaron como se describe anteriormente para los ensayos de activación de E1~Ubl.

El marcaje fluorescente de UblCys0 con maleimida CF488A (Biotium) se realizó según lo recomendado por el fabricante. En resumen, se incubó UblCys0 50 μM con colorante CF488A 150 μM en tampón de conjugación (HEPES 20 mM pH 7,5, NaCl 150 mM, TCEP 0,5 mM) a temperatura ambiente durante la noche. A continuación, las reacciones se extinguieron con DTT 5 mM y se diluyeron para reducir la concentración de NaCl a 50 mM. La mezcla resultante se sometió a la columna EnrichS (BioRad) y se eluyó con un gradiente lineal (para UbCF488A, NH4Ac 50 mM, pH 4,51, NaCl 50–1000 mM; para FAT10CF488A, Bis-Tris 20 mM, pH 6,5, 50–1000 NaCl mM). El UblCF488A purificado se reunió y se concentró.

Las reacciones se llevaron a cabo de manera similar a la formación de tioéster E1~Ubl descrita anteriormente, con algunas modificaciones. Las reacciones contenían E1 100 nM, UblCF488A 0,1–10 μM, MgCl2 5 mM, ATP 500 μM, NaCl 137 mM, KCl 2,7 mM, Na2HPO4 10 mM, KH2PO4 1,8 mM pH 7,4, glicerol al 5 % y TCEP 0,1 mM durante 2 s en la habitación temperatura (TA). Las reacciones se iniciaron agregando ATP y se terminaron agregando tampón SDS-PAGE de urea no reductora y se sometieron a gel NuPAGE Bis-Tris al 4–12 % (Life Technologies), 150 V constante durante 60 min. Se tomaron imágenes de los geles en ChemiDoc MP (BioRad) con el canal Alex488. Se tomaron imágenes de todos los geles con una dilución en serie de una cantidad conocida de FAT10CF488A de modo que cada gel contuviera una curva estándar para convertir la intensidad de la banda en nanomoles de FAT10CF488A con el software ImageJ 1.53 y se analizó con Prism 7.0a (GraphPad) ajustando puntos de datos en Michaelis– Modelo Menten. Las muestras de cada concentración de sustrato se realizaron por triplicado.

Las reacciones contenían E1 100 nM, UblCF488A 2,5 μM, MgCl2 5 mM, ATP 500 μM, NaCl 137 mM, KCl 2,7 mM, Na2HPO4 10 mM, KH2PO4 1,8 mM pH 7,4, glicerol al 5 % y TCEP 0,1 mM para diferentes puntos de tiempo (0– 20 s) a temperatura ambiente (RT). Para puntos de tiempo cortos (25 ms, 100 ms, 500 ms, 1 s), las reacciones se realizaron en un instrumento de flujo de enfriamiento rápido QFM-4000. Para iniciar la reacción, se mezclaron rápidamente 20 μl de una solución que contenía E1 y ATP en la Jeringa 1 con 20 μl de una solución que contenía UblCF488A en la Jeringa 2 a temperatura ambiente, luego se inactivó la reacción con 20 μl de HCl 1 N/3 × no reducción del búfer de carga Urea SDS-PAGE. Para puntos de tiempo largos (2 s, 5 s, 10 s, 20 s), las reacciones se realizaron manualmente. Las reacciones se iniciaron añadiendo ATP y se terminaron añadiendo tampón SDS-PAGE de urea no reductora. Las muestras se sometieron a SDS-PAGE, se tiñeron, visualizaron y cuantificaron como se describe anteriormente para estimar la Km de formación de tioéster Uba6~UblCF488A.

Los ensayos de inhibición de E1~Ubl basados ​​en gel se realizaron incubando 100 nM del E1 indicado con InsP6 de 0 a 50 μM en un tampón que contenía NaCl 137 mM, KCl 2,7 mM, Na2HPO4 10 mM, KH2PO4 1,8 mM pH 7,4 y MgCl2 5 mM. durante 5 min a temperatura ambiente. Posteriormente se añadieron ATP y la Ubl correspondiente hasta una concentración final de 500 μM y 2,5 μM, respectivamente. Las reacciones se incubaron a TA durante 2 sy se terminaron usando tampón SDS-PAGE de urea no reductora. Las muestras se sometieron a SDS-PAGE, se tiñeron y se visualizaron como se describe anteriormente para los ensayos de activación de E1~Ubl. La cuantificación de los datos se realizó mediante densitometría en el software ImageJ 1.53 y se analizó mediante Prism 7.0a (GraphPad) ajustando los puntos de datos en un modelo de respuesta log(inhibición) de 3 parámetros. Los datos se representan como un promedio de tres repeticiones técnicas con barras de error de desviación estándar. Las imágenes sin procesar de geles representativos para todos los ensayos bioquímicos se proporcionan en el archivo de datos de origen.

Se mezclaron 2 μg de dominio SCCH o de longitud completa de proteínas E1 con colorante naranja SYPRO 5x (Thermo Fisher) en HEPES 20 mM pH 7,5, NaCl 150 mM, TCEP 0,25 mM hasta 20 μl en una placa de reacción óptica de 96 pocillos MicroAmp Fast ( Tecnologías de la vida). Cada muestra se preparó por triplicado. Los 96 pocillos se sellaron con película adhesiva óptica MicroAmp (Life Technologies) y luego se colocaron en QuantStudio 3 qRT-RCR (Applied Biosystems). Se ejecutó el método de la curva de fusión: se seleccionó la recolección continua; 25 °C 2 min, 1,6 °C/s; rampa de 0,05 °C/s; 95 °C 2 min. Los datos se guardaron para seguir construyendo curvas de fusión y determinar la temperatura de fusión mediante Prism 7.0a (GraphPad).

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen de informes de investigación de Nature vinculado a este artículo.

Las coordenadas atómicas y los factores de estructura se depositan en el Protein Data Bank (PDB) con el código de acceso 7SOL. Los datos estructurales publicados anteriormente utilizados del PDB se enumeran a continuación: PDB: 6DC6, PDB: 4II2, PDB: 6GF2. Los datos de origen se proporcionan con este documento.

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Los autores agradecen a Patrick Sung y Miklos Bekes por leer críticamente el manuscrito. Los datos de difracción de rayos X se recopilaron en la línea de luz NE-CAT 24-ID-E en Advanced Photon Source, Argonne National Laboratory. Este trabajo se basa en la investigación realizada en las líneas de luz del Equipo de Acceso Colaborativo del Noreste, que están financiadas por el Instituto Nacional de Ciencias Médicas Generales de los Institutos Nacionales de Salud (P30 GM124165). El detector Eiger 16M en 24-ID-E está financiado por una subvención NIH-ORIP HEI (S10OD021527). Esta investigación utilizó recursos de Advanced Photon Source, una instalación de usuarios de la Oficina de Ciencias del Departamento de Energía de EE. UU. (DOE) operada para la Oficina de Ciencias del DOE por el Laboratorio Nacional de Argonne bajo el Contrato No. DE-AC02-06CH11357. La investigación informada en esta publicación fue respaldada por NIH R01 GM115568, R01 GM128731 y CPRIT RR200030 (SKO). Esta investigación utilizó los recursos de las instalaciones básicas de biología estructural, parte de los núcleos de investigación institucionales del Centro de Ciencias de la Salud de la Universidad de Texas en San Antonio, con el apoyo de la Oficina del Vicepresidente de Investigación y el recurso compartido de biología estructural y descubrimiento de fármacos del Mays Cancer Center. (NIH P30 CA054174). El detector Rigaku HyPix-6000HE, el goniómetro universal y la instrumentación óptica VariMax-VHF en las instalaciones centrales de biología estructural están financiados por NIH-ORIP SIG Grant S10OD030374. El contenido de este estudio es responsabilidad exclusiva de los autores y no representa necesariamente los puntos de vista oficiales de los NIH.

Estos autores contribuyeron igualmente: Lingmin Yuan, Fei Gao.

Departamento de Bioquímica y Biología Estructural, Centro de Ciencias de la Salud de la Universidad de Texas en San Antonio, San Antonio, TX, 78229, EE. UU.

Lingmin Yuan, Fei Gao, Zongyang Lv, Digant Nayak, Anindita Nayak, Priscilla Dos Santos Bury, Christine E. Cano, Lijia Jia, Elizabeth V. Wasmuth y Shaun K. Olsen

Departamento de Investigación y Desarrollo, Beijing IPE Center for Clinical Laboratory CO, Beijing, 100176, China

fei gao

Departamento de Bioquímica y Biología Molecular y Centro Oncológico Hollings, Universidad Médica de Carolina del Sur, Charleston, SC, 29425, EE. UU.

Natalia Oleinik, profesora de Firdevs Cansu Atilgan y Besim

Departamento de Pediatría, Facultad de Medicina de la Universidad Johns Hopkins, Baltimore, MD, 21287, EE. UU.

katelyn m williams

Departamento de Bioquímica y Biología Molecular, Universidad del Sur de Alabama, Mobile, AL, 36688, EE. UU.

cristobal davies

UbiQ Bio BV, Science Park 408, 1098 XH, Ámsterdam, Países Bajos

Farid El Oualid

Programa de Oncología Humana y Patogénesis, Centro de Cáncer Memorial Sloan Kettering, Nueva York, NY, 10065, EE. UU.

Isabel V Wasmuth

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La purificación de proteínas se llevó a cabo mediante sondas basadas en actividad sintetizadas, purificadas y validadas de FG, LY, DN, AN y PSBFEO. Los experimentos y análisis estructurales fueron realizados por FG, LY, ZL y SKOLY y FG realizó ensayos bioquímicos y biofísicos. EVW, KEC, LJ, FCA, BO, KMW y CD ayudaron con el diseño experimental y la interpretación de datos. Las figuras y el manuscrito fueron preparados por LY, FG y SKO con aportes de todos los autores.

Correspondencia a Shaun K. Olsen.

FEO declara intereses financieros contrapuestos como cofundador y accionista de UbiQ Bio BV. Todos los demás autores declaran no tener intereses en competencia.

Nature Communications agradece a los revisores anónimos por su contribución a la revisión por pares de este trabajo. Los informes de los revisores están disponibles.

Nota del editor Springer Nature se mantiene neutral con respecto a los reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

Acceso abierto Este artículo tiene una licencia internacional Creative Commons Attribution 4.0, que permite el uso, el intercambio, la adaptación, la distribución y la reproducción en cualquier medio o formato, siempre que se otorgue el crédito correspondiente al autor o autores originales y a la fuente. proporcionar un enlace a la licencia Creative Commons e indicar si se realizaron cambios. Las imágenes u otro material de terceros en este artículo están incluidos en la licencia Creative Commons del artículo, a menos que se indique lo contrario en una línea de crédito al material. Si el material no está incluido en la licencia Creative Commons del artículo y su uso previsto no está permitido por la regulación legal o excede el uso permitido, deberá obtener el permiso directamente del titular de los derechos de autor. Para ver una copia de esta licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Reimpresiones y permisos

Yuan, L., Gao, F., Lv, Z. et al. Las estructuras cristalinas revelan mecanismos catalíticos y reguladores de la enzima Uba6 de doble especificidad ubiquitina/FAT10 E1. Nat Comun 13, 4880 (2022). https://doi.org/10.1038/s41467-022-32613-5

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Recibido: 20 de marzo de 2022

Aceptado: 08 agosto 2022

Publicado: 19 agosto 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-022-32613-5

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