Estructura cristalina de un elemento de replicación de ARN de hoja de trébol 5' enteroviral altamente conservado

Nature Communications volumen 14, Número de artículo: 1955 (2023) Citar este artículo

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El extremo 5′ del genoma de ARN del enterovirus contiene un dominio similar a una hoja de trébol conservado que recluta las proteínas 3CD y PCBP necesarias para iniciar la replicación del genoma. Aquí, informamos la estructura cristalina con una resolución de 1,9 Å de este dominio del genoma CVB3 en complejo con una chaperona de anticuerpos. El ARN se pliega en una unión antiparalela de cuatro vías de tipo H que comprende cuatro subdominios con hélices sA-sD y sB-sC apiladas coaxialmente. Las interacciones de largo alcance entre un A40 conservado en el bucle sC y la hélice Py-Py dentro del subdominio sD organizan orientaciones casi paralelas de las hélices sA-sB y sC-sD. Nuestros estudios de RMN confirman que estas interacciones de largo alcance ocurren en solución y sin la chaperona. Los análisis filogenéticos indican que nuestra estructura cristalina representa una arquitectura conservada de dominios tipo hoja de trébol enterovirales, incluidas las interacciones A40 y Py-Py. Los estudios de unión a proteínas sugieren además que la arquitectura en forma de H proporciona una plataforma preparada para reclutar 3CD y PCBP2 para la replicación viral.

El género enterovirus de la familia Picornaviridae incluye numerosos virus patógenos responsables de muchas enfermedades humanas, como el resfriado común, la poliomielitis, la parálisis flácida aguda y la miocarditis1,2,3. Estos virus contienen un genoma de ARN monocatenario de sentido (+) con aproximadamente 7500 nucleótidos (nts), que está poliadenilado en el extremo 3′ y unido covalentemente con la proteína viral VPg en el extremo 5′ (Fig. 1a)4 ,5,6,7. El genoma completo consta de un único marco de lectura abierto (ORF) flanqueado por las regiones no traducidas (UTR) 5 'y 3' altamente conservadas. El ~750-nt 5′-UTR alberga dominios de ARN modulares esenciales para la traducción y replicación del genoma viral dentro de las células huésped (Fig. 1 complementaria). Aproximadamente 660 nts de la 5′-UTR desde la posición 90 a la 750, ubicada inmediatamente aguas arriba del ORF, contribuyen a un sitio de entrada al ribosoma interno (IRES) que promueve la traducción del genoma viral a través de un mecanismo independiente de la tapa8,9,10,11. Los 90 nts restantes en el extremo 5′ del genoma enteroviral son esenciales para la replicación y se ha propuesto que adopten una estructura secundaria de ARN similar a una hoja de trébol (5′CL) que sirve como plataforma para integrar los factores proteicos virales y celulares requeridos. para iniciar la replicación del genoma viral8,12,13,14,15. Aquí, informamos una estructura cristalina de alta resolución de un ARN de hoja de trébol enteroviral intacto de un miembro de la especie de enterovirus B: el coxsackievirus B3 (CVB3).

un esquema de un genoma de enterovirus que representa la ubicación del 5′CL y su estructura secundaria propuesta con sitios de unión putativos para 3CD viral y proteínas PCBP del huésped. b Estructura secundaria de la construcción de cristalización de CVB3 5'CL2a basada en análisis bioquímicos previos, donde el motivo 5'-GAAACAC-3' del epítopo de unión Fab BL3-6 reemplaza el bucle L2 del subdominio sB. Los nucleótidos coloreados en gris representan las mutaciones o inserciones en comparación con la secuencia de tipo salvaje. c La estructura cristalina del CVB3 5′CL2a se cocristalizó con el Fab BL3-6 y se resolvió a una resolución de 1,9 Å. El Fab está oscurecido en vistas rotadas de la estructura del ARN para mayor claridad. Los paneles de figuras y las etiquetas correspondientes están coloreados de manera análoga para facilitar la comparación.

El 5'CL está altamente conservado entre todos los miembros del género enterovirus. Debido a la alta conservación de las características estructurales entre los 5′CL enterovirales, se ha demostrado que los genomas enterovirales quiméricos con 5′CL intercambiados generan partículas virales viables16,17,18. La estructura secundaria de ARN propuesta consta de cuatro subdominios altamente organizados denominados sA, sB, sC y sD (Fig. 1a). El subdominio sA forma el tallo base de la hoja de trébol, mientras que los subdominios sB, sC y sD se pliegan cada uno en una estructura de bucle de tallo distinta. El subdominio sD recluta la proteína de fusión viral 3CD, un precursor de la proteasa viral 3C y la ARN polimerasa viral dependiente de ARN (RdRp) D, a través de interacciones específicas del bucle sD con la proteasa 3C17,19,20,21. El subdominio sB con una secuencia rica en C en su bucle recluta la proteína de unión a poli(C) del huésped (PCBP) para facilitar la circularización del genoma viral a través de interacciones con la proteína de unión a poli(A) (PABP) complejada con los 3 Cola poli(A) de extremo '19,22,23,24,25,26,27,28,29. Un dominio de ARN de bucle de tallo, cre, dentro de la región de codificación 2C del genoma viral también interactúa con el 3CD30,31,32, promoviendo la uridilación de la proteína viral VPg31,33, que luego sirve como cebador para el (-) Síntesis de ARN de hebras por RdRp D30,34. Además, también se ha demostrado que la secuencia y la integridad estructural de los 5′CL influyen en la uridilación de VPg y la estabilidad genómica, lo que subraya múltiples roles críticos de las características estructurales del ARN dentro de los 5′CL enterovirales14,35. A pesar de las intensas presiones de selección, la alta conservación de la 5'CL en los genomas enterovirales también destaca los requisitos virales para preservar las estructuras de ARN primarias, secundarias y terciarias de la 5'CL para las interacciones con las proteínas derivadas del virus y del hospedador durante el genoma viral. replicación. Sin embargo, carecemos de las estructuras tridimensionales de alta resolución del 5'CL enteroviral intacto, lo que limita nuestra comprensión de este proceso virológico fundamental que tiene un enorme potencial para desarrollar terapias dirigidas contra las infecciones enterovirales.

Se han utilizado varios métodos bioquímicos y biofísicos para estudiar las estructuras de los subdominios enterovirales 5′CL y sus interacciones moleculares con PCBP y las proteínas 3C o 3CD36,37,38,39,40,41,42,43,44. Los estudios anteriores se centraron en comprender las estructuras sD aisladas mediante espectroscopia de resonancia magnética nuclear (RMN), que incluía las estructuras basadas en RMN de los subdominios sD de CVB3, el rinovirus B14 (RVB14) y una secuencia de consenso enteroviral36,37,38,40,43. De acuerdo con los análisis de sondeo químico y SHAPE (acilación selectiva de 2 'hidroxilo analizada por extensión de cebador) en el contexto de los 5'CL de longitud completa o los 5'-UTR completos39,42,45, las estructuras de RMN mostraron un bien conservado estructura de las variantes sD que adopta una arquitectura en forma de horquilla con un vástago helicoidal en forma de A rematado por un tetraloop. Curiosamente, las estructuras también revelaron una región única de pares de bases de pirimidina-pirimidina (Py-Py) dentro del tallo sD, que previamente se predijo que formaría una protuberancia simétrica de 3 × 3 nt. La secuencia y la estructura de esta región están bien conservadas entre todos los enterovirus y, como se mostró anteriormente para CVB3, la deleción de un nucleótido, pero no la mutación puntual compensatoria, en esta región reduce las interacciones sD con la proteasa 3C, lo que sugiere que el la integridad de las características estructurales formadas dentro de la región Py-Py es importante para la unión 3C14,20. Sin embargo, los datos de RMN no respaldaron las interacciones directas entre esta región y la proteasa 3C. Las interacciones directas con la proteína solo involucraron los nucleótidos del bucle sD y dos pares de bases GC que flanquean la región Py-Py38. Más tarde, Warden et al. informó una estructura de RMN de una secuencia sB aislada de 24 nt del RVB14, que se pliega en una horquilla con un tallo helicoidal predominantemente en forma de A rematado por un bucle desordenado de 8 nt41. La región rica en C dentro del bucle, el sitio de reconocimiento para el PCPB huésped, se expuso al solvente, de acuerdo con los estudios bioquímicos anteriores41. La región del tallo tenía un surco principal accesible, lo que indica un sitio potencial para las interacciones de proteínas. Más recientemente, Warden et al. derivó los modelos estructurales del RVB14 5′CL de longitud completa utilizando técnicas de RMN y dispersión de rayos X de ángulo pequeño (SAXS)43. Los modelos estructurales propuestos adoptaron dos conformaciones dependiendo de la presencia y ausencia de Mg2+ en la solución. En ausencia de Mg2+, el 5′CL asumió una conformación extendida similar a una estructura de unión de cuatro vías tipo cK con los subdominios sB y sD residiendo casi perpendiculares entre sí, mientras que en presencia de Mg2+, asumió una forma más compacta. conformación que yuxtapone estos subdominios sB y sD43. Sin embargo, sin las estructuras de alta resolución de otros subdominios (sA y sC) y un 5′CL intacto, los arreglos topológicos de los subdominios 5′CL y las características estructurales que facilitan sus interacciones de unión con el virus 3C, 3CD y el huésped Las proteínas PCPB siguen siendo en gran parte desconocidas.

Aquí, usamos un fragmento de anticuerpo sintético (Fab) como acompañante para cristalizar y determinar la estructura cristalina de resolución de 1,9 Å del 5'CL de longitud completa de CVB3. El ARN se pliega en una arquitectura de unión de cuatro vías de tipo H sin nucleótidos desapareados dentro de la unión. Los subdominios se ensamblan en dos conjuntos de hélices apiladas coaxialmente, y cada apilamiento coaxial forma casi una hélice en forma de A continua. Dentro de la unión de cuatro vías, la hélice sA se apila sobre la hélice sD y la hélice sB sobre la hélice sC. La estructura secundaria derivada del cristal concuerda bien con las derivadas previamente del sondeo bioquímico, SHAPE y los estudios de RMN de subdominios aislados de varios 5'CL. Sorprendentemente, nuestra estructura cristalina reveló una interacción terciaria sin precedentes entre el bucle sB altamente conservado y la región Py-Py de la hélice sD. Estas interacciones concuerdan bien con los resultados de RMN de nuestra solución, lo que indica que las características estructurales observadas en nuestra estructura cristalina representan las de la solución. La disposición única de estas características estructurales también sugiere que son importantes para estabilizar la estructura general del 5'CL que posiciona perfectamente sus subdominios sB y sD para interacciones con proteínas 3C o 3CD y PCBP, lo que concuerda con nuestros estudios de unión utilizando CVB3 recombinante. Proteasa 3C y PCBP2 humana usando calorimetría de titulación isotérmica (ITC) y electroforesis en gel. Nuestra determinación estructural de alta resolución de un 5′CL intacto de un enterovirus facilitará los esfuerzos para comprender la organización estructural y los roles funcionales del 5′CL durante la replicación del genoma enteroviral. Además, dado un alto grado de conservación de la secuencia y la estructura secundaria de los 5'CL entre los enterovirus, este estudio ayudará a comprender el mecanismo de replicación enteroviral mediado por 5'CL, que tiene un enorme potencial para desarrollar terapias específicas para la inhibición de la replicación viral, lo que podría conducir a al tratamiento más efectivo de muchas enfermedades humanas causadas por las infecciones enterovirales.

El CVB3 5′-UTR contiene siete dominios modulares que comprenden estructuras secundarias de ARN altamente organizadas (Fig. 1 complementaria)39. Los dominios designados de II a VII incluyen los elementos IRES responsables de la traducción del genoma viral a través de un mecanismo independiente de cap, mientras que el dominio I representa la estructura 5′CL8,9,10,11,12,13,14,15. La construcción de cristalización de tipo salvaje (WT) de 90 nt del aislado CVB3 28 abarca todo el 5′CL (nts 2 a 88) con dos pares de GC adicionales al comienzo de la hélice sA (Fig. 2 complementaria). Nuestros esfuerzos para cristalizar esta construcción WT 5'CL no tuvieron éxito; por lo tanto, seguimos una estrategia de cristalización de ARN asistida por chaperonas. Hemos estado desarrollando y empleando fragmentos Fab como acompañantes para la cristalización del complejo Fab-RNA y como modelos de reemplazo molecular para la fase inicial durante el proceso de determinación de la estructura46,47,48,49,50,51. Uno de los enfoques de esta estrategia utiliza un módulo de epítopo Fab, que consiste en injertar el epítopo de ARN en el ARN objetivo para permitir su formación de complejos con el Fab, lo que permite la posterior cristalización del complejo Fab-ARN46,47,48,49,50 ,51. Entre otros, Fab BL3-6 ha sido una chaperona muy eficaz para cristalizar y determinar las estructuras cristalinas de alta resolución de varias dianas de ARN46,47,49,50,52,53. El Fab se une a un ARN en horquilla con una secuencia de pentaloop 5'-AAACA-3' cerrada preferiblemente por un par de GC, lo que permite modificar fácilmente la secuencia del epítopo en el ARN objetivo46,47,49,50,52,53.

Sobre la base de las supuestas estructuras secundarias de la 5'CL derivadas de los estudios bioquímicos de sondeo, SHAPE y RMN en la 5'CL intacta y sus dominios aislados, preparamos tres construcciones de ARN separadas, 5'CL2, 5'CL3 y 5'CL4. , para la cristalización reemplazando los bucles L2, L3 y L4 del WT 5'CL con la secuencia 5'-GAAACAC-3' para crear un sitio de unión para el Fab BL3-6 en cada construcción de ARN (Fig. 2 complementaria) . Los ensayos de electroforesis en gel de poliacrilamida nativa confirman que Fab BL3-6 se une explícitamente a estas tres construcciones de ARN (Fig. 3 complementaria), en consonancia con informes anteriores para otras construcciones de ARN injertadas con esta secuencia de unión de Fab BL3-6. Debido a que Fab BL3-6 se une a su secuencia de epítopo solo como un ARN de horquilla, estas observaciones también indicaron que cada subdominio 5'CL, sB, sC y sD, probablemente adopte estructuras de bucle de tallo distintas, en consonancia con estudios bioquímicos y de RMN previos.

Después de las pruebas de unión, configuramos las pruebas de cristalización para las tres construcciones de ARN, 5′CL2, 5′CL3 y 5′CL4, en complejo con Fab BL3-6. Observamos cristales para los complejos 5′CL2 y 5′CL4 pero no para el complejo 5′CL3. De las 480 condiciones seleccionadas para cada complejo, el complejo 5'CL2 cristalizó en menos condiciones (2) que el 5'CL4 (16). Los ensayos análogos para ambas construcciones sin Fab BL3-6 no produjeron ningún cristal, lo que sugiere un papel importante del Fab para facilitar la cristalización de 5'CL2 y 5'CL4. Desafortunadamente, los cristales de estos complejos se difractaron a una resolución de ~8 Å solamente, lo cual fue inadecuado para una determinación de estructura de alta resolución. Para obtener cristales de mejor calidad y un conjunto de datos de difracción de alta resolución, preparamos varias construcciones mutantes 5′CL2 para configurar las pruebas de cristalización en complejo con Fab BL3-6. Para cada mutante de bucle L2, predijimos los modelos de horquilla sD utilizando ROSIE54,55, con especial atención a la conformación tetraloop L2. Los modelos predicen que el mutante G66C adopta una conformación de tetrabucle de tipo GNRA en comparación con un tetrabucle de tipo UNCG para el L2 de tipo salvaje (Fig. 4 complementaria). Como se sabe que los tetrabucles de tipo GNRA facilitan los contactos de cristal56, utilizamos esta mutación G66C en el contexto de 5′CL2, designado 5′CL2a (Fig. 1b), que produjo cristales robustos en complejo con el Fab que se difractó a 1.9 Una resolución. Para el proceso posterior de resolución de estructuras con estos datos, utilizamos una estructura cristalina anterior de Fab BL3-6 (código PDB: 6B14)46 como modelo de reemplazo molecular y obtuvimos fácilmente las fases iniciales. Después de la fase inicial, el mapa de densidad electrónica de alta resolución nos permitió modelar los nucleótidos de ARN sin ambigüedades. Luego, la estructura se resolvió a través de rondas iterativas de reconstrucción y refinamiento del modelo a una resolución de 1,9 Å, y el modelo final del complejo 5′CL2a-BL3-6 convergió con Rwork = 20,9 % y Rfree = 25,9 %. Los detalles de las estadísticas de recopilación y refinamiento de datos se muestran en la Tabla complementaria 1. El modelo estructural final del complejo 5′CL2a-BL3-6 con el 2 | Fo | -|Fc | El mapa de densidad de electrones y el coloreado de acuerdo con los factores B cristalográficos se muestran en las Figs. complementarias. 5 y 6, respectivamente.

La unidad asimétrica cristalográfica (a = 122,20, b = 48,70, c = 144,65, ɑ = 90, β = 112,92 y γ = 90) con un grupo espacial de celosía C 1 2 1 contiene un solo complejo Fab-ARN. El análisis del área interfacial dentro de la celda unitaria utilizando PDBePISA57 reveló que, incluida la interfaz de unión Fab-RNA, los contactos cristalinos Fab-Fab, Fab-RNA y RNA-RNA representan un área de ~142, 2993 y 266 Å2, respectivamente. Si bien Fab realiza la mayoría de los contactos de cristal (~92 %, incluida la interfaz de unión Fab-ARN), las interacciones ARN-ARN a través del apilamiento coaxial de hélices sA relacionadas con la simetría dentro de la red cristalina (Fig. 7 complementaria) representan ~8 % de la zona interfacial. Los contactos de Fab-RNA en la red cristalina que no sean la interfaz de unión implican principalmente interacciones electrostáticas de la

Esqueleto de ARN con cadenas laterales de lisina y arginina de las cadenas pesadas y ligeras de los Fab relacionados con la simetría, lo que indica que Fab facilitó el empaquetamiento de cristales al neutralizar las cargas negativas en la superficie del ARN (consulte la Fig. 8 complementaria para obtener más detalles).

La estructura cristalina de la construcción 5′CL2a de 90 nucleótidos asume una arquitectura de unión de cuatro vías antiparalela de tipo H compacta compuesta por un tallo y tres regiones de bucle de tallo (Fig. 1c). Los cuatro vástagos helicoidales que componen la unión de cuatro vías denominada P1, P2, P3 y P4 se ensamblan en dos juegos de hélices apiladas coaxialmente, donde P1 se apila sobre P4 y P2 se apila sobre P3. Dentro de la unión de cuatro vías, sin nucleótidos desapareados y un apilamiento cruzado perfecto de la hélice P1 G10 con la hélice P4 G47 y la hélice P2 C11 con la hélice P3 C46, ​​cada conjunto de estos apilamientos coaxiales forma casi una hélice continua en forma de A. Como era de esperar, el bucle L2 cierra la hélice P2 y se une al Fab BL3-6, de acuerdo con las interacciones Fab-loop observadas para otras estructuras cristalinas complejas RNA-BL3-646,47,49,50,52,53. De manera similar, un bucle de trinucleótido L3 y un bucle de tetranucleótido L4 cierran las hélices P3 y P4, respectivamente. Una protuberancia de dinucleótido con U49 y A50 separa la hélice P4 en subhélices, P4a y P4b, donde el U49 permanece dentro de la pila helicoidal continua, y A50 sale de la hélice para interactuar con una molécula Fab de pareja de simetría en la red cristalina ( Figura complementaria 8). La hélice P4b contiene una región Py-Py con un par de bases U•U a cada lado del par de bases C•U central.

La estructura secundaria derivada del cristal del 5′CL2a (Fig. 2a) en términos de hélices de pares de bases (P1, P2, P3 y P4), protuberancia de dinucleótido, región de pares de bases Py-Py y bucles (L2, L3 y L4) es consistente con el modelo estructural secundario CVB3 5′CL propuesto anteriormente en el contexto de 5′-UTR completo basado en análisis de reactividad SHAPE y sondeo bioquímico con sulfato de dimetilo (DMS), 1-ciclohexil-3-( 2-morfolinoetil) carbodiimida meto-p-toluenosulfonato (CMCT) y cetoxal (Fig. 1b, consulte la Fig. 9 complementaria para obtener más detalles)39,42,45. Además, las estructuras de todo el subdominio sD y la hélice sB son casi idénticas a las determinadas previamente de forma aislada mediante enfoques de RMN en solución (Fig. 9 complementaria)37,38,40,43, lo que sugiere que nuestra estructura cristalina 5′CL2a representa su conformación de la solución.

a La estructura secundaria derivada del cristal de la construcción CVB3 5′CL2a. La línea de puntos indica interacciones terciarias entre el bucle L3 A40 y la región Py-Py de la hélice P4. b Las interacciones terciarias entre los subdominios sA y sB. c Estructura del bucle de trinucleótido dentro del subdominio sC. d Superposición de los bucles de tallo 5′-ccAUUgg-3′ y 5′-ccUCUgg-3′ (RMSD = 0,44 Å) de las estructuras cristalinas de CVB3 5′CL2a (triloop rojo con tallo púrpura) y Agrobacterium tRNALeu (tRNALeu amarillo , código PDB: 5AH5)60. Solo los nucleótidos del bucle se muestran en detalle para mayor claridad. e Estructura de la protuberancia de dinucleótido dentro de la hélice P4 del subdominio sD. Las líneas discontinuas negras y las esferas rojas en (b) y (e) reflejan heteroátomos dentro de distancias de enlace de hidrógeno y moléculas de agua, respectivamente. La malla gris representa el 2|Fo | -|Fc | mapa de densidad de electrones en el nivel de contorno 1σ y radio tallado 1.8 Å.

En la estructura cristalina de 5′CL2a, los primeros diez nucleótidos (G1–G10, extremo 5′) forman pares de bases canónicos de Watson-Crick con los últimos diez nucleótidos (C81–C90, extremo 3′) para constituir el P1 helix, que representa todo el subdominio sA (Fig. 2a, b). Dentro de la unión P1-P2, ocurre un giro brusco entre G10 y C11, doblando toda la hélice P2 para colocarla casi paralela a la hélice P1 (Fig. 2a, b). Luego, la hélice P2 está cubierta por el bucle L2, el sitio de unión para Fab BL3-6, formando la estructura completa del subdominio sB (Fig. 2a, b). En el WT 5'CL, se espera que el bucle L2 forme un motivo rico en C de ocho nucleótidos que constituye el sitio de unión para el PCBP (Fig. 2 complementaria). Excluyendo el par de bases G20-C26 de cierre del motivo de unión BL3-6, la hélice P2 se compone de nueve pares de bases de Watson-Crick, formando una hélice en forma de A típica (Fig. 2b), que es consistente con el anterior el sondeo bioquímico y los modelos de RMN del subdominio RVB14 sB41, lo que indica que esta estructura de hélice sB está bien conservada entre los enterovirus. Además, observamos contactos terciarios entre los esqueletos de las hélices P1 y P2 a través de interacciones de enlaces de hidrógeno directas y mediadas por agua, estabilizando las yuxtaposiciones generales de sA y sB (Fig. 2b). Específicamente, G83 2′-OH forma un enlace de hidrógeno directo con el oxígeno del fosfato del esqueleto C29. Sin embargo, no observamos una desviación significativa de la hélice P2 de una hélice en forma de A típica, incluido un ensanchamiento del surco mayor, como se propuso anteriormente en base a las estructuras de RMN del subdominio sB de RVB1441. Aunque es posible que las diferencias en los anchos de los surcos principales para las hélices CVB3 y RVB14 sB reflejen las diferencias en las metodologías utilizadas para la determinación de la estructura del ARN58, es probable que las diferencias estructurales entre nuestras hélices CVB3 y RVB14 sB se deban al diferente número de pares de bases. flanqueando la unión de 4 vías que constituye la hélice sB (Fig. 10 complementaria). La hélice sB de nueve pares de bases en el subdominio sB de CBV3 forma un giro helicoidal casi completo en comparación con un poco más de medio giro helicoidal formado por la hélice sB de siete pares de bases en el RVB14. Además, en comparación con todos los pares de bases canónicos en CVB3 sB, la hélice RVB14 sB contiene un par G•U no canónico (Fig. 10 complementaria).

Los cuatro pares de bases canónicos de Watson-Crick que involucran los nucleótidos G36–C39 y G43–C46 forman la hélice P3 (Fig. 2a). Dentro de la unión P2-P3, el G36-C46 de la hélice P3 se apila coaxialmente sobre el G34-C11 de la hélice P2, formando casi una hélice en forma de A continua (Figs. 1c, 2a). Un bucle de trinucleótido L3 con la secuencia 5′-AUU-3′ cierra la hélice P3, de acuerdo con el sondeo bioquímico anterior y los resultados de SHAPE39,42,45. Dentro del bucle (Fig. 2c), un giro brusco en la hélice entre C39 y U41 proyecta el nucleótido A40 fuera del eje helicoidal, lo que permite sus interacciones terciarias con la hélice P4. El nucleótido U41 con conformación glucosídica C2′-endo syn se apila en el par de bases C39-G43 que cierra el bucle, lo que lo hace menos accesible para modificaciones. El segundo giro brusco entre U41 y G43 voltea el nucleótido U42 fuera del eje helicoidal, lo que potencialmente hace contactos de cristal con un Fab de simetría en la red cristalina. Sin embargo, la baja densidad de electrones observada para la base nitrogenada U42 con un factor B alto sugiere su naturaleza altamente dinámica. Estas características estructurales observadas para este tribucle coinciden con los resultados de sondeos bioquímicos previos en la solución de que las nucleobases U41 y U42 en este tribucle eran moderada y fuertemente, respectivamente, susceptibles de modificación por CMCT39,45. Además, aunque los triloops son menos comunes que los tetraloops en las estructuras de ARN, la búsqueda de este motivo de triloop en las estructuras de ARN notificadas anteriormente utilizando la base de datos RNA CoSSMos59 no dio como resultado una secuencia exacta de 5′-AUU-3′ en los triloops. Sin embargo, la estructura de este tribucle 5′-ccAUUgg-3′ era superponible con un tribucle 5′-ccUCUgg-3′ (Fig. 2d, RMSD = 0.44 Å) observado previamente en la estructura cristalina de Agrobacterium tRNALeu (código PDB: 5AH5 )60, lo que sugiere que estos triloops representan una clase distinta de motivos de ARN.

Los nucleótidos C46 y G47 hacen un giro brusco dentro de la unión P3-P4 y doblan toda la hélice P4, lo que la coloca casi paralela a la hélice P3 y permite el apilamiento coaxial con la hélice P1 (Figs. 1c, 2a). Junto a la unión, los pares de bases G47 y C48 con C80 y G79, respectivamente, forman la hélice P4a. Una corneta asimétrica de dinucleótidos con U49 y A50 separa la hélice P4a de la P4b, donde U49 permanece dentro de la pila helicoidal y participa en la formación de bases triples U49•G51-C78 (Fig. 2a, e). Mientras que G51 y C78 forman pares de bases de Watson-Crick, U49 y G51 interactúan a través de los enlaces de hidrógeno de Watson-Crick y Hoogsteen. Además, U49 O4 forma un enlace de hidrógeno con el grupo amino C78. El nucleótido A50 sale de la hélice e interactúa con una molécula Fab de pareja de simetría en la red cristalina, lo que quizás sea crucial para la cristalización (Fig. 8 complementaria). Además, el 2'OH del A50 está dentro de la distancia de enlace de hidrógeno de su N3 y el G51 O4'. De acuerdo con la alta conservación de los nucleótidos abultados, estas características estructurales parecen esenciales para la estabilidad de la hélice sD. Si bien la estructura cristalina puede representar una conformación muestreada de la protuberancia con A50 volteado hacia afuera estabilizado por el contacto del cristal, una fuerte red de enlaces de hidrógeno dentro de la protuberancia respalda una configuración estable en lugar de dinámica de esta protuberancia. Además, el nucleótido 49 está menos conservado en comparación con A50 entre los 5'CL enterovirales, lo que indica que el A50 invertido puede ser importante para las interacciones con las proteínas de unión a 5'CL. La protuberancia quizás ayude a preservar un posicionamiento correcto de la región Py-Py para interacciones terciarias con el bucle sC sin perturbar el eje helicoidal del subdominio sD. Después del abultamiento, los nucleótidos C52–A61 forman pares de bases Watson-Crick con U68–G77, incluidos los pares de bases Py-Py altamente conservados. En la región Py-Py, los nucleótidos U55, C56 y U57 forman pares de bases con U74, U73 y U72 a través de enlaces de hidrógeno de Watson-Crick no canónicos (Fig. 3a). Curiosamente, la doble hélice Py-Py es ligeramente más estrecha (diámetro fosfato a fosfato = 16,8 ± 0,3 Å, Fig. 3b) en comparación con las dobles hélices que flanquean la región (diámetro fosfato a fosfato = 18,6 ± 0,6 Å, Fig. 3b), lo cual es consistente con observaciones previas en modelos NMR de CVB3 y RVB14 sDs36,37,38,40,43. Sin embargo, estos emparejamientos de bases Py-Py consecutivos inusuales (U55•U74, C56•U73 y U57•U72) no crearon una deformación significativa dentro del P4 de una hélice estándar en forma de A ni alteraron las posiciones relativas de los extremos helicoidales (ver Fig. 11 complementaria para más detalles). Finalmente, el bucle L4 con un par de bases de cierre oscilante U62•G67, ​​que asume una estructura de tetrabucle bien definida (Figs. 1c, 2a), tapa la hélice P4.

a La estructura cristalina de los pares de bases Py-Py dentro de la hélice P4 de CVB3 5′CL2a. b La distancia de fosfato a fosfato entre los pares de bases a lo largo de la hélice P4. c Superposición de la estructura cristalina sD del subdominio CVB3 5′CL2a (cian) con estructuras de RMN previamente notificadas de los subdominios sD para CVB3 5′CL (azul) y una secuencia de consenso enteroviral (magenta). d Superposición de solo la región Py-Py para las tres estructuras como se describe en (c). e El ancho de ranura principal dentro de la hélice P4. Las líneas negras discontinuas representan las distancias entre Pi y Pi+6 a lo largo de la hélice. f La estructura de tetrabucle de tipo GNRA observada en la construcción de cristalización 5'CL2a. g El tetrabucle tipo UNCG, como se observa en la estructura de RMN anterior del subdominio sD aislado de CVB3 5′CL38. Las líneas discontinuas negras (a), (b) y (e) representan heteroátomos dentro de las distancias de enlace de hidrógeno. La malla gris en (c) y (d) representa el 2|Fo | - |Fc | mapa de densidad de electrones en el nivel de contorno 1σ y radio tallado 1.8 Å.

Para comparar las características estructurales observadas del subdominio sD con los modelos de RMN informados anteriormente, superpusimos la estructura cristalina del subdominio sD con los modelos de RMN anteriores (estructuras de energía más baja) de sD para CVB3 y una secuencia de consenso enteroviral (Fig. 3c, RMSD = 1.947 Å y 3,461 Å, respectivamente)37,38. Si bien observamos algunas diferencias en las estructuras L4 de protuberancia y bucle, las estructuras de la hélice Py-Py fueron muy similares (Fig. 3d, RMSD = 0.430 Å y 1.266 Å, respectivamente). Curiosamente, en contraste con nuestra estructura cristalina, la estructura sD de consenso mostró U49 volteada y A50 apilada helicoidalmente. Esta configuración permite la formación de una red de enlaces H que involucra a C48, U49, A50 y G77, incluida una base triple A50•C48-G77 en lugar de la U49•G51-C78 observada en la estructura cristalina (Fig. 12 complementaria). De acuerdo con esta observación, estudios previos que utilizan sistemas libres de células han demostrado que una protuberancia de un solo nucleótido es suficiente para la síntesis de la cadena (-)14,20. Cada configuración puede existir, o el pliegue general de unión de cuatro vías del CVB3 5′CL2a favorece la configuración de protuberancia observada en la estructura cristalina, ya que el modelo de RMN se derivó para un subdominio sD aislado. Excluimos el modelo CVB3 sD NMR para esta comparación ya que este modelo incluía la secuencia solo después de la protuberancia. Luego, medimos el ancho del surco principal dentro de la hélice P4 (Fig. 3e). La distancia media medida entre Pi (a partir de G47) y Pi+6 a través de la hélice P4 es de 11,5 ± 2,9 Å, lo que es consistente con el ancho de ranura principal observado para muchas otras estructuras cristalinas de ARN (11,1 ± 2,2 Å)58. El ancho de ranura principal medido para la hélice P2 del subdominio B en nuestra estructura cristalina también es similar al de la hélice P4 (11,6 ± 1,4 Å), lo que sugiere que las hélices P2 y P4 no presentan desviaciones significativas en los anchos de ranura principal. , lo que contradice las reivindicaciones anteriores basadas en los modelos de RMN de las hélices sD y sB que tienen un surco principal ensanchado para proporcionar sitios de interacción para la unión de la proteína correspondiente. El ancho de ranura principal promedio para las estructuras anteriores basadas en RMN es de 15,7 ± 4,7 Å58, lo que quizás refleja que los anchos de ranura principales ampliados sugeridos para las hélices sB y sD se deben a algunas ambigüedades asociadas con el modelado de RMN.

Estudios bioquímicos y de RMN previos han demostrado que el bucle sD es necesario y suficiente para la unión de 3Cpro viral14,20,36,37,38. Debido a que CVB3 3Cpro se une promiscuamente con los subdominios sD de otros enterovirus con tetraloops pero no se une con RVB14 sD con un triloop20, estos estudios también sugirieron que 3Cpro reconoce la característica estructural general dentro del bucle sD en lugar de una secuencia definida20,37,38. Sin embargo, ninguno de estos estudios previos analizó las consecuencias de la mutación G66 altamente conservada en la unión de 3Cpro. Nuestra estructura CVB3 5′CL2a resuelta a una resolución de 1,9 Å contiene una mutación G66C. La construcción con el bucle sD de tipo salvaje produjo cristales, pero se difractaron a una resolución de solo ~ 8 Å, lo que sugiere que esta mutación era necesaria para una cristalización robusta. Más interesante aún, esta única mutación parece importante para la conformación general del tetraloop sD. Mientras que el bucle L4, 5′-auCACCgu-3′, dentro del subdominio sD de nuestra estructura cristalina adopta un pliegue tetraloop tipo GNRA (N = cualquier nucleótido; R = A o G) (Fig. 3f), estudios previos de RMN con CVB3 El subdominio sD y un consenso enteroviral han demostrado que el bucle sD WT, 5′-auCACGgu-3′, adopta un pliegue tetraloop tipo UNCG (N = cualquier nucleótido) (Fig. 3g)36,37. Esto significa que la secuencia del bucle sD, especialmente el cuarto nucleótido del bucle, también es crucial para mantener una conformación de tetrabucle específica del bucle sD, lo que es consistente con la alta conservación de G66 en los 5'CL enterovirales. En consecuencia, se ha demostrado que la inserción de G como el cuarto nucleótido del tribucle RVB14 sD para formar un tetrabucle restaura su unión a CVB3 3Cpro a un nivel similar al de CVB3 5'CL20.

Para comprender la base estructural de la unión de 3Cpro con el 5'CL y para validar la relevancia funcional de nuestra estructura cristalina, probamos la unión de un CVB3 3Cpro recombinante con nuestras construcciones de cristalización de ARN. Basándonos en estudios previos61, mutamos la cisteína catalítica (C147) de la 3Cpro a alanina para evitar su potencial actividad de proteasa. Los ensayos ITC mostraron que CVB3 3Cpro se une a las construcciones WT y 5'CL2 con afinidades similares (Kd aparente = 1,40 ± 0,14 µM y 1,30 ± 0,09 µM, respectivamente), lo que sugiere que el injerto de la secuencia de unión Fab en el bucle sB casi no tuvo efecto en el enlace 3Cpro con el bucle sD (Fig. 4a, b; consulte la Fig. 13 complementaria para obtener más detalles). La construcción 5′CL4 con el bucle sD reemplazado por el pentaloop de unión a Fab mostró una afinidad mucho más débil (Kd aparente = 9,4 ± 3,0 µM en comparación con 1,40 ± 0,14 µM para el 5′CL2), lo que sugiere que el 3Cpro reconoce específicamente el bucle sD dentro del CVB3 5'CL (Fig. 4b; consulte los detalles de la Fig. 13 complementaria). Sorprendentemente, en comparación con el ARN 5'CL2, la construcción de cristalización 5'CL2a que contenía una mutación G66C dentro del bucle sD mostró una unión mucho más débil con el 3Cpro (Kd aparente = 17,0 ± 8,0 µM, Fig. 4b; consulte la Fig. 13 complementaria). para más detalles), lo que sugiere un papel crítico de G66 en el reconocimiento de la proteína 3Cpro. Sin embargo, el posicionamiento relativo de G66 en el tipo UNCG y C66 en el tetraloop tipo GNRA es similar (Figura 4 complementaria), lo que indica que la conformación tetraloop juega un papel importante en la unión de 3Cpro más allá de las interacciones específicas de secuencia. Tomados en conjunto, estos análisis respaldan que 3Cpro reconoce un tetraloop de tipo UNCG dentro del bucle sD, y cualquier mutación que cause alteraciones en esta estructura anula la unión de 3Cpro con los 5'CL enterovirales.

un perfil ITC representativo para el WT 5′CL. El calor se libera con inyecciones sucesivas de 2 l de CVB3 3C (~400 μM) a la solución de ARN (~10 μM) en la celda de calorimetría. b, c Las curvas de unión de los datos de ITC para la unión del 3C con varias construcciones de ARN de cristalización (consulte las Fig. 13, 14 y 15 complementarias para obtener más detalles). d Estructura del CVB3 5′CL2a, que muestra las interacciones terciarias entre los subdominios sC y sD, especialmente el acoplamiento del bucle sC A40 en la región Py-Py de la hélice P4 dentro del subdominio sD. e Los detalles de las interacciones terciarias de tipo A-menor entre el par de bases A40 y C56•U73 dentro de la región Py-Py. f Un modelo de mutación A40U que muestra la interrupción de las interacciones A-menor entre el bucle sC y la hélice Py-Py. g Las curvas de unión de los datos de ITC para la unión de 3C con el mutante A40U de la construcción original 5'CL2. Las líneas discontinuas negras en (d), (e) y (f) representan heteroátomos dentro de las distancias de enlace de hidrógeno. La malla gris en d y e representa el 2|Fo | - |Fc | mapa de densidad de electrones en el nivel de contorno 1σ y radio tallado 1.8 Å.

Aunque los mutantes del bucle sD mostraron una afinidad reducida por 3Cpro, las afinidades observables de estos mutantes sugieren contactos adicionales de 3Cpro con 5'CL. Para probar esta hipótesis, realizamos estudios de unión de 3Cpro con la protuberancia de dinucleótido y los mutantes Py-Py. La eliminación de la protuberancia de dinucleótido al agregar los nucleótidos complementarios (5'CL-sD-NB, Fig. 14 complementaria) mostró una afinidad ~ siete veces menor (Kd aparente = 10,1 ± 2 µM, Fig. 4c) con el 3Cpro en comparación con el WT 5'CL (Kd aparente = 1,4 ± 0,14 µM, Fig. 14 complementaria), lo que indica contactos directos de los nucleótidos abultados con el 3Cpro. Sin embargo, una construcción (5'CL-sD-CN, Fig. 14 complementaria) con la región Py-Py reemplazada por los pares de bases canónicos muestra una afinidad similar (Kd aparente = 3,4 ± 0,7 µM, Fig. 4c) como el WT 5 ′CL, lo que respalda que es menos probable que la región Py-Py participe directamente en la unión de 3Cpro. Además, de acuerdo con los informes anteriores20, un subdominio sD aislado (sDi, Fig. 15 complementaria) se une a 3Cpro con una afinidad similar (Kd aparente = 2,1 ± 0,12 µM, Fig. 4c) como el 5′CL WT intacto, lo que sugiere que el El subdominio sD es suficiente para la unión de 3Cpro a través de interacciones específicas del bucle sD y la protuberancia sD. Además, los estudios de unión de 3Cpro con construcciones sD aisladas con el emparejamiento canónico de bases de U49A50 (sDi-NB, Kd aparente = 5 ± 0,1 µM), solo U49 (sDi-U49P, Kd aparente = 4,9 ± 0,87 µM) o solo A50 (sDi-A50P, Kd aparente = 3,5 ± 0,6 µM) indican que la estructura general de la protuberancia es crítica para la unión de 3Cpro en lugar de la identidad del nucleótido protuberante (consulte la Fig. 15 complementaria para las construcciones y los datos de ITC). Estos resultados son consistentes con dos conformaciones diferentes de la protuberancia que se observaron en la NMR37 anterior y nuestras estructuras cristalinas, y los estudios de replicación in vitro que muestran la eliminación de U49A50 pero no de U49 o A50 o el intercambio de sus posiciones anuló la síntesis de la cadena (-)14 ,20.

Nuestra estructura cristalina del CVB3 5'CL de longitud completa reveló interacciones terciarias extensas entre los subdominios sC y sD, incluidas interacciones sin precedentes entre el bucle L3 y la región emparejada basada en Py-Py de la hélice P4. Primero, los esqueletos helicoidales P3 y P4 interactúan a través de una red de enlaces de hidrógeno directos y mediados por agua (Fig. 4d). Los oxígenos de fosfato G75 y U74 forman enlaces de hidrógeno directos con los grupos 2'OH de G44 y C38, respectivamente. Los oxígenos de fosfato G75 también participan en los enlaces de hidrógeno mediados por agua con los grupos N3, 2′OH y amino de G44. Además de estos contactos entre los subdominios sC y sD, curiosamente, nuestra estructura cristalina reveló que el bucle L3 A40 se acopla en el surco menor de la hélice Py-Py a través de interacciones de tipo A-menor (Fig. 4e). El A40 entra en contacto con el C56 y el U73 a través de interacciones de enlaces de hidrógeno de Watson-Crick-Sugar-Edge y Hoogsteen-Sugar-Edge, formando una base triple A40•C56•U73. Específicamente, los grupos 2'OH C56 y U73 interactúan con A40 N1 y N7, respectivamente, y sus O2 con el grupo amino A40 a través de enlaces de hidrógeno directos (Fig. 4e). Para validar este acoplamiento del A40 en solución, realizamos estudios de RMN para la construcción 5′CL2. Al aplicar diferentes variaciones de los esquemas de etiquetado A2RU6R (ver Métodos), observamos señales NOE (Efecto Overhauser nuclear) entre los A40 H2 y H1 de dos uracilos (Fig. 16 complementaria), que es consistente con las interacciones A40 y Py-Py en nuestra estructura cristalina, donde el H1 'de U57 y U74 están cerca del H2 de A40 (<4 Å, Fig. 16 complementaria).

Se sabe que los cationes divalentes como Mg2+ estabilizan las estructuras terciarias del ARN. Sin embargo, la presencia o ausencia de Mg2+ en la solución no alteró significativamente las afinidades de unión de 3Cpro con las construcciones 5′CL (para 5′CL2, Kd aparente con 10 mM Mg2+ = 1,4 ± 0,2 µM en comparación con 1,30 ± 0,09 µM en una solución dializada de Mg2+), lo que respalda que las estructuras terciarias de largo alcance, en comparación con las características estructurales secundarias, dentro del 5′CL pueden no tener un efecto importante en la unión de 3Cpro. En particular, los espectros de RMN 1D y 2D para la construcción CVB3 5'CL2a en una solución con Mg2+ 5 mM y una solución dializada con Mg2+ son casi superponibles (Fig. 17 complementaria). Solo se observan pequeños cambios químicos dependientes de la sal, pero no cambios importantes o cambios en la intensidad de los picos debido a cambios estructurales más grandes, lo que sugiere que, a diferencia del RVB14 5′CL20, el CVB3 5′CL se pliega en el tipo H compacto. Unión de 4 vías independiente del Mg2+ en la solución. De acuerdo con los resultados de RMN, no observamos ningún sitio de unión de Mg2+ prominente en la estructura cristalina, incluso a una resolución de 1,9 Å, aunque la condición de cristalización contenía al menos 10 mM de Mg2+.

Las interacciones de largo alcance entre los nucleótidos A40 y Py-Py altamente conservados entre los 5′CL enterovirales sugieren que estos nucleótidos pueden tener funciones importantes para la unión de 3Cpro con la estructura 5′CL. Como era de esperar, la mutación A40 o Py-Py desestabilizaría la estructura terciaria de 5′CL (ver Fig. 4f) y reduciría la afinidad de unión de 3Cpro. Sin embargo, la mutación A40U dentro del sC-triloop de CVB3 5′CL2 tuvo poco efecto en la unión de 5′CL con 3Cpro (Kd aparente = 3,10 ± 0,22 µM en comparación con Kd = 1,40 ± 0,14 µM para 5′CL2 (Fig. 4g; Fig. 14 complementaria). Sin embargo, esta ligera disminución en la afinidad por el mutante A40U puede deberse a cambios conformacionales menores dentro de la estructura 5'CL inducida por esta mutación A40U (ver Fig. 4f). Estos resultados también concuerdan con nuestras mediciones de ITC para 5'CL de tipo salvaje intacto y un subdominio sD aislado para la unión de 3Cpro (Kd aparente = 1,4 ± 0,14 µM y 2,10 ± 0,12 µM, respectivamente; Fig. 4b, c, Figs. 13 y 15 complementarias), como así como las afinidades previamente informadas de estas construcciones de ARN para 3Cpro basadas en un ensayo de unión a filtro (Kd aparente = 2,7 y 4,6 µM, respectivamente)20, lo que respalda que las interacciones A40 no tienen un papel directo en la unión de 3Cpro. el 5′CL de tipo salvaje y el 5′CL-sD-CN (el Py-Py reemplazado por pares canónicos) se construyen de manera similar (Fig. 4c; Figs suplementarias. 14 y 15), en consonancia con la observación anterior de que el reemplazo de la hélice Py-Py con pares de bases canónicas no eliminó la síntesis de la hebra (-)14. Sin embargo, como se muestra en un ensayo de tres híbridos de levadura, la eliminación de U74 anuló, pero la mutación C56U compensatoria todavía preservó la unión de 3Cpro con 5'CL20. Tomando en conjunto nuestros resultados estructurales y de unión de 3Cpro, es evidente que la integridad de la protuberancia de dinucleótido y el bucle que preservan la estructura general del subdominio sD son necesarios para una unión eficaz de 3Cpro, y las interacciones terciarias A40U-Py-Py tienen consecuencias más allá el enlace 3Cpro.

Presumimos que un papel estructural más prominente de estas interacciones es estabilizar la unión de 4 vías del 5'CL que posiciona el sitio de unión de 3Cpro (bucle sD) lejos del sitio de unión de PCBP del host (bucle sB) para evitar posibles choques estéricos entre 3Cpro y PCBP durante el montaje de la maquinaria de replicación. Para probar esta hipótesis, expresamos y purificamos de forma recombinante la proteína PCBP2 humana de longitud completa y realizamos los ensayos de unión mediante electroforesis en gel (Fig. 18 complementaria). Como se ha demostrado que PCBP2 se une tanto al bucle sB como a la región espaciadora rica en C entre el 5′CL y el IRES, también realizamos pruebas de unión con las construcciones de ARN más largas que contienen tanto el 5′CL como la región espaciadora. De acuerdo con los estudios previos de que PCBP2 reconoce el bucle sB, observamos que WT 5'CL pero no el mutante de bucle sB 5'CL2 se une a PCBP2. Curiosamente, el mutante A40U, que no tuvo ningún efecto sobre la unión de 3Cpro, interactúa con PCBP2 con mucha menos afinidad en comparación con WT 5′CL, lo que sugiere que la interacción A40-Py-Py tiene algunas funciones en la unión de PCBP2 a 5′CL. estructura. Sorprendentemente, la construcción de ARN más larga 5'CLWTSP con el bucle sB y la secuencia espaciadora se une fuertemente al PCBP2 en comparación con el 5'CL sin el espaciador, lo que indica que el bucle sB y la secuencia espaciadora residen cerca uno del otro, lo que es consistente con la yuxtaposición observada de los subdominios sA y sB en nuestra estructura cristalina. Aunque el efecto de la interacción A40-Py-Py en la unión de PCBP2 y la función 5′CL aún debe estudiarse a fondo, nuestros resultados preliminares sugieren que la estructura 5′CL en forma de H estabilizó esta yuxtaposición de contacto de largo alcance A40-Py-Py los sitios de unión de PCBP2, el bucle sB y el espaciador bien separados del sitio de unión de 3Cpro, el subdominio sD.

Para estudiar la relevancia estructural de los nucleótidos dentro de los 5′CL enterovirales, realizamos un análisis filogenético utilizando herramientas bioinformáticas. La alineación de más de 5000 secuencias del genoma enteroviral muestra un alto grado de conservación de la secuencia dentro de la región 5'CL (Figura 19 complementaria). La estructura secundaria de consenso calculada (Fig. 5a; Fig. 20 complementaria) de estas alineaciones de secuencias para siete genotipos enterovirales usando R-Scape62 indica que las características estructurales dentro de cada subdominio sA, sB, sC y sD están altamente conservadas, de acuerdo con el Estructura secundaria de consenso propuesta previamente del 5′CL enteroviral en la base de datos Rfam63 obtenida al alinear 162 secuencias de 87 especies de enterovirus únicamente. En particular, los nucleótidos clave observados en nuestra estructura cristalina CVB3 5′CL, incluidos los abultamientos A40, Py-Py y sD, están absolutamente conservados, lo que sugiere el requisito viral de mantener estos nucleótidos frente a una fuerte presión de selección. Curiosamente, la estructura secundaria de consenso optimizada de R-scape62 predice el subdominio sC como una hélice de cuatro pares de bases cerrada por un tribucle con el A40 absolutamente conservado como el tercer nucleótido dentro del tribucle. De manera similar, el subdominio sD contiene una hélice de 6 pares de bases altamente conservada entre la unión de cuatro vías y la región de pares de bases Py-Py. La hélice también está interrumpida por una protuberancia de dos nt entre el segundo y el tercer par de bases que siguen a la unión de cuatro vías. La conservación de la longitud y la estructura secundaria dentro de los subdominios sC y sD (Fig. 21 complementaria) con esta disposición específica tal vez sea necesaria para mantener las interacciones específicas entre el bucle L3 y la región emparejada basada en Py-Py, en consonancia con las interacciones terciarias observadas. en nuestra estructura cristalina.

a Modelo estructural secundario propuesto de 5'CL enteroviral de consenso (consulte también la Fig. 20 complementaria para obtener más detalles). Los 5'CL son uno de los elementos de ARN más conservados entre los enterovirus (b) El pliegue de consenso tridimensional de los 5'CL en los genomas enterovirales se basa en la estructura cristalina de CVB3 5'CL que muestra los modos de unión de 3CD viral y PCBP huésped proteinas Las líneas discontinuas rojas representan interacciones terciarias y muestran el apilamiento coaxial de los subdominios correspondientes.

Hay dos pasos distintos en la replicación del genoma enteroviral. El primero es la síntesis de ARN de cadena (-) utilizando el ARN genómico como plantilla, y el segundo es la síntesis posterior del ARN genómico de cadena (+) utilizando el ARN de cadena (-) recién creado como plantilla. El 5'CL es uno de los principales componentes de la maquinaria de replicación del genoma enteroviral que se une directamente a factores proteicos virales y celulares para formar un complejo RNP competente en replicación. El subdominio sD de 5'CL interactúa con la proteína de fusión viral 3CD a través de su 3Cpro que lleva la polimerasa viral Dpol al sitio de inicio de la replicación. El subdominio sB se une a PCBP2, que luego interactúa con el complejo de cola PABP-poli(A) en el extremo 3′ para circularizar el genoma viral. El 3CD también interactúa con cre, un dominio de ARN de bucle de tallo ubicado dentro de la región codificante de 2C, para promover la uridilación de la proteína VPg viral. El VPg-pUpU resultante luego sirve como cebador para la síntesis de ARN de cadena (-) por polimerasa Dpol activa, un producto de autoescisión del precursor 3CD. Además, la secuencia de ARN conservada y las características estructurales en el 5'CL influyen en la uridilación de VPg y la estabilidad del genoma viral y pueden facilitar la maquinaria de replicación para reconocer el genoma enteroviral en un medio de innumerables ARN celulares64. Por lo tanto, las estructuras de alta resolución de los 5′CL y los correspondientes complejos RNP con 3C o 3CD y PCPB brindan información importante no solo para una comprensión detallada de los mecanismos de replicación del genoma enteroviral, un proceso virológico poco conocido, sino también para el desarrollo de fármacos. que apuntan a esta plataforma. Aunque los enfoques virológicos, de biología molecular, bioquímicos y biofísicos previos han facilitado cierta comprensión estructural y funcional de los 5′CL para iniciar la replicación del genoma enteroviral y cómo sus subdominios interactúan con las proteínas 3C o 3CD y PCPB a niveles moleculares36,37,38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, nuestra estructura cristalina CVB3 5′CL representa la primera estructura de alta resolución de un 5′CL intacto de cualquier enterovirus, lo que sienta las bases para una mayor investigación sobre la 5′CL mediada por mecanismos de replicación enterovirales.

Las estructuras secundarias generales de los 5'CL de CVB3 y RVB14, incluidos los modelos derivados de RMN para los subdominios sC y sD aislados, son casi idénticas. Sin embargo, la arquitectura tridimensional de nuestra estructura cristalina CVB3 5′CL difiere significativamente en comparación con los modelos RVB14 5′CL. A diferencia del modelo RVB14 5′CL43, nuestra estructura cristalina adopta una unión de 4 vías tipo H con los subdominios sA-sD y sB-sD apilados coaxialmente, yuxtaponiendo sA con sB y sC con sD. Estas discrepancias quizás estén relacionadas con la baja resolución de la técnica SAXS y el modelado computacional de la estructura 5'CL intacta basada en las estructuras de RMN de los subdominios sB y sD aislados solo sin considerar las estructuras de los subdominios sA y sC. Además, utilizando los enfoques NMR y SAXS, Warden et al. 43 propusieron previamente los modelos estructurales dependientes de Mg2+ para el RVB14 5′CL de longitud completa. Sin el Mg2+, el RVB14 5′CL asumió una conformación extendida similar a una unión de 4 vías tipo cK con los subdominios sB y sD residiendo casi perpendiculares entre sí, pero con el Mg2+, el mismo ARN se plegó en una conformación más compacta que yuxtapone los subdominios sB y sD. Además, RVB14 5′CL mostró un cambio sustancial en los desplazamientos químicos de RMN para los nucleótidos involucrados en la hélice Py-Py tras la adición de Mg2+43, que no era consistente con lo observado para el mismo subdominio sD aislado40. Sin embargo, estas observaciones son consistentes con la estabilización de la región Py-Py a través de interacciones terciarias con el bucle L2 como se observa en nuestra estructura cristalina CVB3 5′CL intacta. Aunque las conformaciones dependientes de Mg2+ de varios 5′CL enterovirales aún no se han estudiado en detalle, a diferencia de los resultados anteriores con RVB14, nuestros resultados preliminares de RMN respaldan que CVB3 5′CL se pliega en una estructura de unión de 4 vías tipo H compacta independiente del Mg2+ en la solución, lo que sugiere las diferentes funciones del Mg2+ en la estabilización de diferentes 5′CL enterovirales.

Estudios previos han demostrado que la eficacia de la replicación del genoma enteroviral depende de los sitios de interacción de las proteínas PCBP y 3C o 3CD dentro de la estructura 5'CL. El subdominio sD es necesario y suficiente para el enlace 3C. En consecuencia, la protuberancia, la región Py-Py y las estructuras tetraloop son las regiones más conservadas dentro del subdominio sD que influyen significativamente en la síntesis de ARN de cadena (+) y (-). Para CVB3, la eliminación de la protuberancia del dinucleótido U49A50 inhibió la síntesis de la cadena (-), pero las mutaciones A49U50 para intercambiar estas posiciones de nucleótidos y la eliminación de los nucleótidos U49 o A50 casi no tuvieron efecto, lo que sugiere que una protuberancia de un solo nucleótido es suficiente para la ( -)-síntesis de cadena. Sin embargo, la síntesis de la cadena (+) requería un abultamiento de dinucleótido intacto. Si bien la eliminación de U74 dentro de la hélice Py-Py eliminó la unión de 3C con 5′CL, los datos de RMN anteriores no respaldaron las interacciones directas de la proteína con los nucleótidos en la región Py-Py. Sin embargo, reemplazar el par C56•U73 con el par U56•U73 conservó el enlace 3C con el 5′CL. Otros estudios que utilizaron ensayos libres de células para PV y CVB3 mostraron que la eliminación completa del desajuste de Py-Py con los pares de bases de Watson-Crick aumentó la síntesis de la cadena (-) mientras disminuía la síntesis de la cadena (+), lo que sugiere que Py-Py La región en el subdominio sD es esencial para mantener la proporción de cadenas de ARN (-) y (+) durante la infección viral. Estructuralmente, la región Py-Py mantiene una helicidad de forma A, cualquier mutación que no altere la helicidad de forma A aún permitiría las interacciones de tipo A-menor entre el bucle sC y la región Py-Py, pero un escenario similar es menos probablemente en una estructura análoga en el extremo 3' de la hebra (-). Quizás el requisito para la región Py-Py en el 5'CL es más prominente en la síntesis de cadena (+) utilizando una plantilla de ARN de cadena (-). Está más allá del alcance de este estudio estudiar las estructuras de las estructuras de ARN análogas formadas dentro del extremo 3′ de la cadena (-) de ARN, pero nuestra estructura cristalina respalda que la región Py-Py estabiliza la estructura general de 5′CL. a través de interacciones terciarias con el bucle sC. Además, el subdominio sD aislado muestra una afinidad de unión similar a la del CVB3 5'CL intacto, lo que sugiere que las características estructurales absolutamente conservadas en el subdominio sD entre los enterovirus son importantes más allá de la unión de la proteína 3C. Además, aunque aún no se han investigado los efectos de las mutaciones del bucle sC, incluido el A40, en la síntesis de las cadenas (-) y (+), la conservación absoluta del A40 frente a la intensa presión de selección subraya su necesidad de mantener la integridad de estos interacciones terciarias para la replicación del genoma viral.

Una comparación de nuestra estructura CVB3 5′CL con otros enterovirus y rinovirus sugiere que las longitudes de la hélice P3 (cuatro pares de bases) y la hélice P4 que preceden a la región Py-Py (seis pares de bases interrumpidos por la protuberancia del dinucleótido) son las características estructurales más conservadas. Estas características subrayan un requisito específico para posicionar los pares A40 y Py-Py para facilitar las interacciones terciarias entre los subdominios sC y sD. Estas interacciones terciarias dentro del 5'CL son más pronunciadas cuando se consideran los sitios de unión de PCBP. Dentro del 5′CL enteroviral, el PCBP interactúa con el bucle sB y una secuencia espaciadora rica en C al final de la estructura 5′CL; la última secuencia contribuye más a las interacciones de unión. Las mutaciones en secuencias ricas en C dentro del subdominio B y la región espaciadora anulan la unión de PCBP y deterioran la síntesis de ARN de cadena (-), lo que respalda que la unión de PCBP en estas regiones es fundamental para la replicación eficiente del genoma enteroviral19,27,28. A diferencia de los modelos propuestos anteriormente de RVB14 5′CL con la yuxtaposición de los subdominios sD y sB, nuestra estructura cristalina de CVB3 5′CL reveló la yuxtaposición de los subdominios sA y sB, acercando el bucle sB y la secuencia espaciadora rica en C (Fig. 5b), que es consistente con nuestros estudios preliminares de unión con PCBP2 humano y respalda esas observaciones bioquímicas anteriores. Por lo tanto, las interacciones terciarias entre el bucle sC y las regiones Py-Py juegan un papel importante en la estabilización de la estructura 5'CL y el posicionamiento preciso de los bucles sB y sD, proporcionando una plataforma lista para que los componentes de replicación se unan en lugar de involucrarse directamente. de estas subestructuras con las interacciones 5′CL-proteína. Sin embargo, estudios adicionales para determinar las estructuras de alta resolución de los 5′CL enterovirales en complejo con la proteína viral 3C o 3CD correspondiente y la proteína PCPB2 del huésped establecerán pasos críticos hacia una comprensión mecánica de la replicación enteroviral y el desarrollo de terapias potenciales dirigidas a esta plataforma de replicación enteroviral. .

Las construcciones de ARN para estudios de cristalización, unión a proteínas y RMN se sintetizaron mediante transcripción in vitro. La plantilla de ADN con una secuencia promotora T7 para la reacción de transcripción se produjo mediante amplificación por PCR de ssDNA adquirido de Integrated DNA Technologies. Los dos primeros nucleótidos del cebador inverso se modificaron con 2'-OMe para reducir la heterogeneidad del extremo 3' del transcrito65. El ARN se transcribió durante 3 h a 37 °C en un tampón que contenía Tris-HCl 40 mM, pH 8,0, espermidina 2 mM, NaCl 10 mM, MgCl2 25 mM, DTT 1 mM, 40 U/ml inhibidor de la RNasa, 5 U/ml TIPPase, 5 mM de cada NTP, 50 pmol/ml de plantilla de ADN y 50 μg/ml de polimerasa de ARN T7 casera66. La reacción de transcripción se detuvo agregando 10 U/ml de ADNasa I (Promega) e incubando a 37 °C durante 1 h. Para sintetizar las muestras de RMN, el ARN se transcribió utilizando los NTP marcados adquiridos en Cambridge Isotope Laboratories. El ARN se transcribió durante 8 horas y la reacción se inactivó con urea 500 mM y EDTA 60 mM, seguido de ebullición de la mezcla durante 5 minutos. Todas las muestras de ARN se purificaron mediante electroforesis en gel de poliacrilamida desnaturalizante (dPAGE). La banda se visualizó mediante sombra UV, se cortó del gel y se eluyó durante la noche a 4 °C en Tris 10 mM, pH 8,0, EDTA 2 mM y NaCl 300 mM. El tampón de ARN eluido se intercambió con agua pura tres veces usando una columna Amicon de corte de 10 kDa (Millipore Sigma). El ARN se recogió, se dividió en alícuotas en fracciones de 300 μl y se almacenó a -80 °C hasta su uso posterior. Para las muestras de RMN, el ARN se purificó aún más mediante precipitación con etanol antes de liofilizarse y cambiarse el tampón para las mediciones de RMN.

El plásmido de expresión Fab BL3-6 fue un amable obsequio de Joseph Piccirilli, de la Universidad de Chicago. El Fab se purificó según los protocolos publicados52,67,68. Brevemente, el plásmido se transformó en células competentes de E. coli 55244 y se sembró en una placa de agar LB con 100 µg/ml de carbenicilina. Se seleccionaron varias colonias para inocular un cultivo iniciador de 15 ml y se cultivaron a 30 °C durante 8 h. A continuación, el cultivo iniciador se usó para inocular 1 litro de medio 2xYT y las células se cultivaron durante 24 ha 30 °C. Para la sobreexpresión de Fab, las células se centrifugaron a 22 °C y 6000 × g durante 10 min, se resuspendieron en 1 litro de medio empobrecido en fosfato y se cultivaron durante 24 h a 30 °C. Las células se recogieron mediante centrifugación a 4 °C y 6000 × g durante 10 min, se resuspendieron en PBS, tampón de pH 7,4 con 0,01 mg/ml de ADNasa I de páncreas bovino (Sigma-Aldrich) y fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF) 400 mM. lisado por sonicación (Qsonica, Cole-Parmer). La mezcla primero se centrifugó a 40 000 × g, el lisado transparente se filtró a través de un filtro de 0,45 micras (VWR) y el Fab se purificó mediante el sistema de cromatografía líquida de proteínas rápida (FPLC) Bio-Rad NGC. En primer lugar, el lisado se pasó a través de una columna de proteína A Hi-trap (Cytiva) y el Fab capturado se eluyó con ácido acético 0,1 M. Las fracciones se recogieron, se diluyeron 10x usando tampón PBS, pH 7,4, y se cargaron en una columna de proteína G Hi-trap (Cytiva). Las fracciones Fab eluidas de la columna de proteína G en glicina 0,1 M, pH 2,7, se recogieron, se diluyeron 10x con un tampón de NaOAc 50 mM, NaCl 50 mM, pH 5,5 y se cargaron en una columna de heparina Hi-trap (Cytiva). Finalmente, se recogieron las fracciones Fab eluidas de la columna de heparina mediante el gradiente de elución con NaOAc 50 mM, NaCl 2 M, tampón de pH 5,5 y se intercambió el tampón 3x con PBS 1x pH 7,4 usando una columna Amicon de corte de 30 kDa (Millipore Sigma) . El Fab concentrado se recogió, se analizó mediante SDS-PAGE al 12 % y se probó la actividad de RNasa utilizando el kit RNaseAlert (Ambion, www.thermofisher.com). Se almacenaron alícuotas (~300 μl) de Fab purificado a -80 °C.

El ARN en agua (~100 ng) se replegó en un tampón que contenía Tris-HCl 10 mM, pH 7,4, MgCl2 10 mM y NaCl 100 mM. El ARN se calentó a 90 °C durante 1 min y se añadió un volumen apropiado de tampón de replegamiento 10x, seguido de incubación a 50 °C durante 10 min y luego en hielo durante 5 min. A continuación, el ARN replegado se incubó durante 30 min a temperatura ambiente con diferentes equivalentes de proteína Fab o 3C. Las muestras del complejo proteína-ARN se mezclaron con un volumen apropiado de solución de carga de gel de agarosa nativa 6x que contenía glicerol al 30 %, azul de bromofenol al 0,1 % y cianol de xileno. Estas muestras se cargaron en geles de poliacrilamida nativa al 10 % y se procesaron a 115 V en tampón TBE 0,5x preenfriado (base Tris 50 mM, ácido bórico 50 mM y EDTA 1 mM, pH 7,5) a 4 °C. Los geles se tiñeron con bromuro de etidio y se tomaron imágenes utilizando el sistema de documentación de geles Azure 200 (Azure Biosystems).

La muestra de ARN se volvió a plegar en un tampón de plegamiento que contenía Tris-HCl 10 mM, pH 7,4, MgCl2 10 mM y NaCl 100 mM. En primer lugar, se calentó el ARN en agua a 90 °C durante 1 min y se añadió un volumen apropiado de tampón de replegamiento 10x, seguido de incubación a 50 °C durante 10 min y en hielo durante 5 min. A continuación, el ARN replegado se incubó durante 30 min a temperatura ambiente con 1,1 equivalentes de Fab y se concentró a 6 mg ml−1 utilizando una columna Amicon Ultra-1 de corte de 10 kDa (Millipore Sigma). Luego, los complejos Fab-ARN se pasaron a través de unidades de filtro centrífugo Millipore con un corte de 0,2 μm (www.emdmillipore.com). El robot de manipulación de líquidos Xtal3 Mosquito (TTP Labtech, ttplabtech.com) se utilizó para configurar pantallas de cristalización por difusión de vapor de gotas colgantes en RT utilizando kits de detección disponibles comercialmente de Hampton Research y Jena Bioscience. Los cristales se formaron en una semana en diversas condiciones. Las condiciones seleccionadas se optimizaron aún más para el pH, el precipitante y la concentración de sal para hacer crecer cristales más grandes utilizando el método de difusión de vapor de gota colgante. Los cristales crecieron hasta su tamaño completo durante una semana. Para la crioprotección, las gotas que contenían cristales adecuados se llevaron al 30% de glicerol sin cambiar las otras composiciones. Los cristales se congelaron inmediatamente en nitrógeno líquido después de extraerlos de las gotas y llevarlos al Laboratorio Nacional de Argonne para recopilar los datos de difracción de rayos X.

Los conjuntos de datos de difracción de rayos X se recopilaron en las líneas de luz 24-ID-C y 24-ID-E de la sección NE-CAT de Advanced Photon Source. Luego, todos los conjuntos de datos se integraron y escalaron utilizando sus programas automatizados RAPD en el sitio (https://rapd.nec.aps.anl.gov/rapd/). Las fases iniciales se obtuvieron mediante reemplazo molecular con la estructura previamente informada de Fab BL3-6 (PDB: 6B14 como modelo de búsqueda usando Phaser en Phenix69. La construcción y el refinamiento iterativo del modelo se realizaron usando COOT70 y el paquete Phenix69. El ARN fue construido sin ambigüedades por modelando los nucleótidos individuales en el mapa de densidad de electrones obtenido del reemplazo molecular. Durante el refinamiento, se usaron opciones NCS predeterminadas y parámetros TLS seleccionados automáticamente en Phenix. La mayoría de las moléculas de agua fueron determinadas automáticamente por el software Phenix durante los refinamientos. Sin embargo, algunas moléculas de agua se agregaron manualmente para la densidad de electrones positivos en el mapa en función de su posibilidad de formar enlaces de hidrógeno con proteínas o residuos de ARN. El área de superficie accesible al solvente y el área de interacción se calcularon utilizando (http://www.ebi.ac.uk/ pdbe/pisa/) 57. Las figuras relacionadas con la estructura se realizaron en PyMOL (The PyMOL Molecular Graphics System, Version 2.0 Schrödinger, LLC), y las etiquetas de las figuras se editaron en CorelDraw (Corel Corporation, http://www.corel.com) .

El CVB3 3Cpro recombinante se expresó y purificó utilizando protocolos descritos anteriormente con algunas modificaciones20,38,61. La secuencia de ADN con codón optimizado que codifica el mutante CVB3 3Cpro C147A se clonó en el vector pET-22b(+) entre los sitios de restricción NdeI y XhoI (GenScript, https://www.genscript.com). La proteína expresada contenía la secuencia MGPAFEFAVA MMKRNSSTVK TEYGEFTMLG IYDRWAVLPR HAKPGPTILM NDQEVGVLDA KELVDKDGTN LELTLLKLNR NEKFRDIRGF LAKEEVEVNE AVLAINTSKF PNMYIPVGQV TEYGFLNLGG TPTKRMLMYN FPTRAGQAGG VLMSTGKVLG IHVGGNGHQG FSAALLK HYF NDEQ con la etiqueta 6x-His codificada por vector en el terminal C. El plásmido de expresión se transformó en BL21 (DE3) E.coli y las células se cultivaron en un medio 2xYT suplementado con 100 μg/mL de carbenicilina a 37 °C con agitación de 220 rpm hasta una DO de ~0,6. A continuación, se indujo la expresión de proteínas en las células mediante el uso de IPTG (isopropiltio-β-galactósido) hasta la concentración final de 0,5 mM, se cultivaron durante 6 horas a 25 °C y, finalmente, se recolectaron mediante centrifugación a 6000 x g. La purificación de proteínas se llevó a cabo en un sistema Bio-Rad FPLC. El sedimento celular se resuspendió en un tampón de lisis que contenía Tris HCl 50 mM, pH 7,5, NaCl 300 mM e imidazol 5 mM y se lisó mediante sonicación. El lisado se centrifugó a 40 000 × g a 4 °C y el sobrenadante se pasó a través de un filtro de 0,45 micras. Luego, el lisado clarificado se aplicó a una columna HisTrap™ (Cytiva) y la proteína se eluyó de la columna con un tampón (Tris HCl 50 mM, NaCl 300 mM e imidazol 250 mM, pH 7,5) después de lavar la columna con 5 volúmenes de columna del tampón de lisis. Las fracciones eluidas se recogieron, se dializaron frente a un tampón que contenía Tris HCl 50 mM, KCl 100 mM, EDTA 1 mM y glicerol al 5 %, pH 7,5, y se purificaron más mediante cromatografía de exclusión por tamaño (HiLoad® 26/600 Superdex® 200 pg columna, Cytiva). Las fracciones de proteína de un solo pico se agruparon y concentraron utilizando los filtros centrífugos Amicon (límite de peso molecular de 10 kDa, Millipore Sigma), se congelaron rápidamente con N2 líquido en pequeñas alícuotas y se almacenaron a -80 °C.

La PCBP2 humana de longitud completa (residuos 11–359) con la etiqueta C-terminal 6x-His se expresó y purificó utilizando los protocolos descritos anteriormente con algunas modificaciones28,71. Brevemente, la secuencia de ADN con codón optimizado que codifica la proteína PCBP2 humana se clonó en el vector pET-22b(+) entre los sitios de restricción NdeI y XhoI (GenScript, https://www.genscript.com). La expresión y la purificación se realizaron utilizando un procedimiento similar al descrito anteriormente para 3Cpro. El tampón de lisis contenía Tris 50 mM (pH 7,5), NaCl 300 mM e imidazol 20 mM, mientras que el tampón de elución de la columna HisTrap contenía Tris 50 mM (pH 7,5), NaCl 300 mM e imidazol 250 mM. Las fracciones eluidas se recogieron, se dializaron frente a un tampón que contenía Tris 50 mM (pH 7,5), KCl 100 mM, EDTA 1 mM y glicerol al 5 %, y se purificaron más mediante cromatografía de exclusión por tamaño con HiLoad® 26/600 Superdex® 75 pg columna. Las fracciones de proteína de un solo pico se agruparon y concentraron usando los filtros centrífugos Amicon (peso molecular límite de 30 kDa), se congelaron rápidamente con N2 líquido en pequeñas alícuotas y se almacenaron a -80 °C hasta su uso posterior.

Los experimentos de calorimetría de titulación isotérmica (ITC) se llevaron a cabo en el equipo MicroCal PEAQ-ITC Automated (Malvern Panalytical) utilizando muestras de proteína y ARN recién preparadas. Las muestras de ARN y proteína se dializaron durante la noche en un tampón que contenía Tris HCl 50 mM, pH 7,5, KCl 100 mM, EDTA 1 mM y glicerol al 5%. La jeringa de inyección contenía 150 μl de ~400 μM de proteína 3Cpro y la celda de calorimetría se cargó con 500 μl de ~10 μM de ARN. Después del equilibrio térmico a 25 °C y un retraso inicial de 60 segundos, se realizó una única inyección de 200 nl seguida de 19 inyecciones en serie de 2 μl de proteína 3Cpro en la celda de calorimetría. El Kd informado para cada construcción de ARN representa el promedio ± desviación estándar obtenido de los experimentos por triplicado.

Las muestras de ARN se midieron en D2O al 100 % (99,8 %, Cambridge Isotope Laboratories) con fosfato de sodio 20 mM, pH 7,4, KCl 70 mM, NaCl 5 mM y MgCl2 5 mM (a menos que se describa de otra manera) en un tubo de 5 ml a concentraciones variando de 0,7 a 1,2 mM. Los datos fueron recolectados con un espectrómetro Bruker AVANCE (600 MHz, 1H) a 308 K con un esquema de muestreo ponderado72. Las asignaciones de 1H no intercambiables se obtuvieron a partir de datos 2D NOESY (tiempo de mezcla NOE = 300 ms, retraso de relajación = 12,0 s, T = 308 K). Todos los datos de RMN se procesaron con NMRFX73 y se analizaron con NMRViewJ74. Las asignaciones parciales se realizaron utilizando la estrategia de asignación secuencial estándar basada en NOE75,76 en muestras de ARN marcadas con A2RUR, U6R y A2R siguiendo las estrategias que fueron pioneras en estudios anteriores77. Las asignaciones se validaron mediante comparaciones con valores de desplazamiento químico en el repositorio de NMR de BioMagResBank utilizando NMRViewJ78,79,80. Además, las asignaciones anteriores se utilizaron para transferir y validar de forma cruzada algunas de nuestras asignaciones36,37.

A menos que se especifique lo contrario, los experimentos asociados con PAGE nativa, SDS PAGE e ITC se realizaron por triplicado. Cada réplica produjo resultados similares.

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen de informes de Nature Portfolio vinculado a este artículo.

Las coordenadas atómicas y los factores de estructura para la estructura cristalina informada se han depositado en el Protein Data Bank con el código de acceso 8DP3. Los autores proporcionarán los datos sin procesar, la información adicional y los materiales, incluido el plásmido para la expresión de Fab BL3-6, previa solicitud. Las solicitudes deben dirigirse a DK

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Este trabajo fue apoyado por los premios start-up, SURFF y START de la Universidad de Maryland Baltimore County y el premio NSF CAREER 2236996 a DK y en parte por la subvención NIH T32 GM066706 a NKD El trabajo cristalográfico se basa en la investigación realizada en el Northeastern Líneas de luz del equipo de acceso colaborativo (24-ID-C y 24-ID-E), financiadas por el Instituto Nacional de Ciencias Médicas Generales de los Institutos Nacionales de Salud (P30 GM124165). El detector Eiger 16 M en 24-ID-E está financiado por una subvención NIH-ORIP HEI (S10OD021527). Esta investigación utilizó los recursos de la fuente avanzada de fotones, una instalación de usuario de la Oficina de Ciencias del Departamento de Energía de EE. UU. (DOE) operada para la Oficina de Ciencias del DOE por el Laboratorio Nacional de Argonne bajo el Contrato No. DE-AC02-06CH11357. Los autores desean agradecer al personal de Advanced Photon Source en Argonne National Laboratory por brindar asesoramiento técnico durante la recopilación de datos. Agradecemos al Prof. Michael Summers, de la Universidad de Maryland, Condado de Baltimore, por brindarnos amablemente las instalaciones de RMN e ITC y por los comentarios constructivos sobre el manuscrito.

Departamento de Química y Bioquímica, Universidad de Maryland Condado de Baltimore, Baltimore, MD, 21250, EE. UU.

Naba K. Das, Nele M. Hollmann, Jeff Vogt, Hasan A. Banna, Manju Ojha y Deepak Koirala

Instituto Médico Howard Hughes, Universidad de Maryland Condado de Baltimore, Baltimore, MD, 21250, EE. UU.

Nele M. Hollmann

Departamento de Bioquímica y Biología Molecular, Facultad de Medicina de la Universidad de Maryland, Baltimore, MD, 21201, EE. UU.

Spiridon E. Sevdalis

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NKD y DK concibieron y diseñaron los experimentos. NKD preparó las muestras, realizó la mayoría de los experimentos y resolvió las estructuras cristalinas con la ayuda de DKNMH, que recopiló y analizó los datos de RMN. JV realizó todos los trabajos de bioinformática y computación. SS diseñó y montó ensayos iniciales de cristalización. HAB y MO ayudaron a NKD con experimentos bioquímicos y recopilando datos de difracción de rayos X. NKD analizó la mayoría de los datos bioquímicos y cristalográficos e interpretó los resultados con DKNKD y DK escribieron el manuscrito, y todos los autores revisaron críticamente el manuscrito.

Correspondencia a Deepak Koirala.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Nature Communications agradece a Benjamin Akiyama y a los otros revisores anónimos por su contribución a la revisión por pares de este trabajo. Los informes de los revisores están disponibles.

Nota del editor Springer Nature se mantiene neutral con respecto a los reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

Acceso abierto Este artículo tiene una licencia internacional Creative Commons Attribution 4.0, que permite el uso, el intercambio, la adaptación, la distribución y la reproducción en cualquier medio o formato, siempre que se otorgue el crédito correspondiente al autor o autores originales y a la fuente. proporcionar un enlace a la licencia Creative Commons e indicar si se realizaron cambios. Las imágenes u otro material de terceros en este artículo están incluidos en la licencia Creative Commons del artículo, a menos que se indique lo contrario en una línea de crédito al material. Si el material no está incluido en la licencia Creative Commons del artículo y su uso previsto no está permitido por la regulación legal o excede el uso permitido, deberá obtener el permiso directamente del titular de los derechos de autor. Para ver una copia de esta licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Reimpresiones y permisos

Das, NK, Hollmann, NM, Vogt, J. et al. Estructura cristalina de un elemento de replicación de ARN de hoja de trébol 5' enteroviral altamente conservado. Nat Comun 14, 1955 (2023). https://doi.org/10.1038/s41467-023-37658-8

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Recibido: 28 julio 2022

Aceptado: 23 de marzo de 2023

Publicado: 07 abril 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-023-37658-8

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