La influencia de la secuencia y la dinámica de la unión de Holliday en el autocristal de ADN

Nature Communications volumen 13, Número de artículo: 3112 (2022) Citar este artículo

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La síntesis programable de arquitecturas cristalinas diseñadas racionalmente para la disposición precisa de especies moleculares es un objetivo fundamental en la nanotecnología, y el ADN se ha convertido en una de las moléculas más destacadas para la construcción de estos materiales. En particular, las uniones de ADN ramificadas se han utilizado como bloque de construcción central para el ensamblaje de redes 3D. Aquí, la cristalografía se utiliza para sondear el efecto de las 36 secuencias de unión de Holliday inmóviles en los cristales de ADN autoensamblados. Contrariamente al paradigma establecido en el campo, la mayoría de las uniones producen cristales, y algunos mejoran la resolución o dan como resultado simetrías de cristal únicas. Inesperadamente, incluso la secuencia adyacente a la unión tiene un efecto significativo en los ensamblajes de cristal. Seis de las secuencias de uniones inmóviles son completamente resistentes a la cristalización y, por lo tanto, se consideran "fatales", y las simulaciones de dinámica molecular revelan que estas uniones invariablemente carecen de dos sitios de unión de iones discretos que son fundamentales para la formación de cristales. Las estructuras y la dinámica que se detallan aquí podrían usarse para informar diseños futuros de cristales y nanoestructuras de ADN de manera más amplia, y tienen implicaciones potenciales para la ingeniería molecular de la nanoelectrónica aplicada, la nanofotónica y la catálisis dentro del contexto cristalino.

La fabricación de arquitecturas basadas en ADN 3D altamente personalizables para la organización precisa de materiales a nanoescala fue conceptualizada originalmente por Seeman en 19821. Se ha desarrollado una variedad de metodologías que permiten el autoensamblaje programable, incluida la unión de conectores de ADN a la nanopartícula ( NP) superficies2,3 para la construcción de redes 3D con configuraciones de cristal coloidal NP definidas por el usuario4,5,6,7,8. Con la llegada del origami de ADN9, se han descrito superredes 3D de formas de grupos de nanopartículas10,11 junto con redes de origami 3D que muestran una geometría personalizable para albergar especies invitadas12. También se ha demostrado que los cristales diseñados racionalmente basados en el motivo de "tensegridad"13 que se autoensamblan con puntos de cruce de unión de cuatro brazos diseñados y cohesión de "extremo pegajoso" pueden convertirse en nanodispositivos14. Recientemente, se han informado varios motivos únicos con simetrías cristalinas distintivas, resolución mejorada y, en un caso, una secuencia de nucleótidos de unión única15,16,17,18.

La aplicación de uniones de cuatro vías para cristales de ADN 3D se inspiró en la recombinación genética, mediante la cual se crea un intermedio ramificado inestable denominado unión de Holliday (HJ) y, posteriormente, se somete a una reconfiguración dinámica para facilitar la recombinación durante la división celular19. Las uniones de Holliday se han caracterizado estructuralmente de manera extensa20,21,22,23,24,25,26,27,28,29, y surgieron como un motivo clave para ensamblajes y dispositivos a nanoescala diseñados racionalmente en nanotecnología de ADN estructural1,30 Las HJ naturales pueden " deslizarse" y cambiar la longitud de sus brazos31,32, proceso conocido como migración de ramas33. Sin embargo, la introducción de secuencias asimétricas en el punto de ramificación inmoviliza efectivamente la unión y permite su uso en la construcción de nanoestructuras bien definidas34. Aunque se ha empleado una variedad de uniones de múltiples ramas35,36,37,38,39,40,41, la HJ de cuatro brazos sigue siendo la más popular.

Teóricamente, existen combinaciones de 36 pares de bases de secuencias inmóviles. "J1" fue el primero en diseñarse42,43 y se ha utilizado casi exclusivamente en la construcción de cristales 3D autoensamblados13,15,16,17 con una única excepción en la que se utilizó "J10"18. Algunos trabajos anteriores exploraron la influencia de la secuencia en el empaquetamiento de uniones X apiladas utilizando métodos teóricos44,45 o experimentales46,47, pero hasta donde sabemos, no se ha realizado ningún estudio sistemático de las HJ inmóviles. Además, la relación entre la concentración de iones y la transición de la HJ de la conformación abierta a la apilada es bien conocida20,25,48,49,50,51; sin embargo, los estudios de los efectos de la secuencia sobre la capacidad de unir iones son limitados, lo que hace que la elucidación de los parámetros estructurales que influyen en la cristalización y la simetría sea una ruta deseable para la exploración.

En este trabajo, investigamos exhaustivamente la capacidad de las 36 secuencias HJ inmóviles para formar cristales de ADN en dos sistemas diseñados diferentes. Nuestro trabajo reveló que una gran mayoría de HJ inmóviles permiten la cristalización, y algunas producen estructuras de mayor resolución y una variedad de simetrías. La simetría también es muy sensible a la secuencia de los brazos de unión (tallos) más alejados del punto de ramificación, como demostramos usando secuencias de tallos revueltos. También se observaron sitios de unión de iones únicos en dos posiciones conservadas dentro de las estructuras. Al realizar simulaciones de dinámica molecular (MD) de los 36 HJ en solución, mostramos que estos sitios son fundamentales para la cristalización, con las uniones "fatales" universalmente no cristalizantes que muestran una capacidad cero para unir iones de esta manera. Aunque limitado por el muestreo, el modelado utilizado en este trabajo proporciona una imagen confiable de la flexibilidad dependiente de la secuencia y los efectos solventes de los 36 HJ inmóviles en relación con las redes cristalinas de ADN autoensambladas. En general, el trabajo proporciona una descripción rigurosa y completa de cómo las diferentes secuencias HJ inmóviles, las modificaciones de la secuencia flanqueante y la capacidad de la unión para capturar iones afectan profundamente el diseño racional de los sistemas autoensamblados que abarcan una multitud de arquitecturas de ADN de diseño.

En este informe se describen tres sistemas separados de cristales de ADN autoensamblados: los diseños "4 × 5"15 y "4 × 6"16 (denominados colectivamente sistemas 4 × N), y una tercera construcción con un diseño "codificado" variante de secuencia de las redes de 4 × 6. El autoensamblaje estuvo mediado por tres oligonucleótidos constituyentes (Fig. 1a): (S1) que contenía cuatro repeticiones de secuencia de 5 o 6 bases; (S2) compuesto por 21 bases que contienen regiones complementarias a ambos (S1); y (S3) que forma el segundo cruce de unión (Fig. 1b). Cada unidad asimétrica podría definirse como un HJ que contiene 10 y 11 pb en cada brazo, o como un dúplex lineal de 21 pb (Fig. 1 complementaria). Ambas versiones se resolvieron en paralelo, lo que arrojó un total de 134 estructuras cristalinas (Tabla complementaria 1 para recopilación de datos y estadísticas de refinamiento). Las redes cristalinas contienen matrices continuas compuestas por una serie de "bloques" de cristal que se autoensamblan en una serie de dúplex de 21 pb unidos por la hebra 4xN. El HJ sirve como el componente fundamental en el núcleo de cada unidad, y el ensamblaje final de la red completa se ve facilitado por los extremos adhesivos complementarios de 2 bases que siguen a cada dúplex. Las secuencias "flanqueantes" en el 4 × 6 original también se modificaron en lados opuestos para identificar cualquier papel que la secuencia descendente pudiera desempeñar en el comportamiento de cristalización, independientemente o junto con la propia secuencia HJ.

a Tres oligonucleótidos median la cristalización de dos motivos de autoensamblaje (4 × 5 y 4 × 6) junto con una variante de secuencia "revuelta". Se muestra un ejemplo representativo de un cristal 3D. b La estructura de la unión de Holliday es el bloque de construcción clave para el ensamblaje y contiene cuatro brazos que usan dos oligonucleótidos (S1; rojo) y (S3; bronceado) que sirven como hebras cruzadas, con S2 (verde) que sirve como un tercer "lineal" hebra complementaria en cada lado. La región complementaria de S1 contenía cinco o seis bases (N pb) en cada brazo antes de cada cruce, momento en el cual se repite una secuencia idéntica en cada brazo consecutivo por un total de cuatro veces (4×N) antes de comenzar la serie nuevamente (4 × 5 o 4 × 6). Posteriormente, S1 sirve como andamiaje para toda la red. c El "bloque" de construcción central que facilita el montaje 3D. S1 une cuatro dúplex de 21 pb con la unión Holliday (en caja; translúcida) en el centro de la estructura. El oligonucleótido de ssDNA lineal de 21 bases (S2) comprende la mitad de cada dúplex con la segunda hebra cruzada (S3) flanqueando cada extremo (encuadrado). Cada dúplex está seguido por "extremos pegajosos" complementarios (asteriscos) de 2 pb que se unen para formar matrices 3D continuas. d Bases representativas donde se impuso asimetría de secuencia para evitar el "deslizamiento" de las hebras para crear 36 uniones inmovilizadas. e Tres simetrías únicas (P3221, P32 y R3) están dictadas por la hebra de andamiaje 4×N que trabaja en conjunto con la secuencia en cada unión inmóvil. f Las 36 secuencias de uniones inmóviles representadas en un formato de unión de Holliday abierto con cada hebra coloreada de acuerdo con (b). Los nucleótidos en cada hebra correspondiente se indican con las posiciones de secuencia en cada oligonucleótido componente correspondiente al esquema coloreado en (d).

Aquí, probamos el espacio de la secuencia de unión creando un panel de 36 HJ inmóviles (Fig. 1f) en cada sistema mientras consideramos un solo isómero fijo para determinar si las uniones distintas de J1 eran capaces de cristalizar y potencialmente producir una resolución mejorada, y para identificar aquellos que resultó fatal. Las secuencias se definieron explícitamente en cada cadena de unión constituyente (todas las secuencias de oligonucleótidos componentes se pueden encontrar en los Datos complementarios 1 y la Tabla complementaria 2), o cuando se definen como un dúplex de 21 pb (Fig. 1, Fig. 2 complementaria y Fig. complementaria . 3). Para confirmar definitivamente una unión como fatal, se realizó una evaluación rigurosa (Tabla complementaria 3) para clasificar de manera concluyente cada secuencia (consulte "Métodos" en la Información complementaria para obtener detalles técnicos). Las estructuras resultantes contenían tres simetrías diferentes (P3221, P32 y R3) que se describen en detalle a continuación (Fig. 1e, Fig. 4 complementaria).

La estructura original de 4 × 5 que contenía la secuencia de unión J1 dio como resultado una matriz estructuralmente tensa, presumiblemente debido al devanado del componente central strand15. El motivo en capas proporcionó un andamiaje bien definido con una resolución de 3,1 Å, pero la aperiodicidad de las cavidades y los volúmenes correspondientes serían inadecuados para andamiaje de materiales invitados. Presumimos que podría ser posible introducir otras secuencias inmóviles únicas que podrían proporcionar ligeras perturbaciones en el ángulo de unión, para reducir potencialmente la tensión en el sistema original y producir una red periódica "relajada".

El sistema 4 × 5 cristalizó sólidamente con el 75% de las uniones, y obtuvimos cristales en todas menos 9 de 36 secuencias (Fig. 5 complementaria y Tabla 4 complementaria). Las uniones J2 y J30 cristalizaron, pero eran de calidad inadecuada para la solución estructural y, por lo tanto, se clasificaron como fatales. De las estructuras resultantes, 18 exhibieron simetría P32 con dimensiones de celda promedio a = b = 68,85 Å c = 60,09 Å, y solo nueve conservaron la simetría P3221 original con bordes de celda promedio a = b = 68,17 Å c = 60,60 Å (Tabla complementaria 5 ). Aunque los parámetros de celda entre las dos simetrías eran prácticamente indistinguibles (Fig. 2a, Fig. 6 complementaria), las diferencias entre la periodicidad de las redes son dramáticas, con tamaños de cavidad muy diferentes (Fig. 2b, c). Si bien la resolución más alta alcanzada para el sistema J1 fue de 3,1 Å, en aproximadamente la mitad de los cristales medidos, las resoluciones fueron de 3,05 Å o mejores, y tan altas como 2,9 Å (J6) y 2,75 Å (J19), para las simetrías P32 y P3221 , respectivamente (Tabla complementaria 6).

a Estructuras superpuestas de las uniones J5 (bronceado) y J3 (rojo) 4 × 5 que contienen simetrías P3221 y P32, respectivamente. La alineación de la unión tenía un valor RMSD global de 1,34, con ángulos interdúplex calculados de 58,18° y 55,20°, respectivamente. No se aprecian diferencias visuales significativamente obvias; sin embargo, la influencia global resultante que puede tener una diferencia de ángulo incluso modesta en el empaquetamiento general es evidente en (b, c). b Instantánea de la red completa J5 P3221 (4 × 5) que contiene una matriz aperiódica de cavidades que no serían adecuadas para el andamiaje de moléculas huésped de cualquier tamaño apreciable. Las dos cavidades de tamaño único se muestran con recuadros negros. Se indican los anchos para cada cavidad respectiva. Cada cavidad abarca la longitud de una sección transversal de un dúplex (~2,0 nm). En la Fig. 8 complementaria se incluyen vistas alternativas de la red, incluidas las mediciones en cada orientación. Una sola cavidad se resalta con un cuadro negro con un ancho de 4,0 nm y que también abarca la longitud de una sección transversal de un dúplex (~ 2,0 nm). En la figura complementaria 8 se incluyen vistas alternativas de la red que incluyen medidas en cada orientación.

Los volúmenes de cavidad de las redes P3221 se calcularon en función de los bordes de 3 nm de los poros a lo largo del eje de simetría triple del cristal con una altura de prisma triangular de 6,1 nm, correspondiente al eje c promedio de la celda unitaria ( Figura complementaria 7). La red aperiódica contenía cavidades con anchos de 1,0 y 1,7 nm a intervalos alternos, y produjo volúmenes de poro extremadamente pequeños de ~ 24 nm3 (Fig. 2b; Fig. 7a complementaria). Los canales P32 se trataron como un prisma hexagonal con 6,4 nm a lo largo de cada borde y una altura medida desde la parte superior hasta la parte inferior de cada bloque junto con el eje c promedio = 6,0 nm (Fig. 7b complementaria), con un volumen resultante de ~639 nm3, un aumento de casi 27 veces en el tamaño de la cavidad en relación con las redes P3221. Las coordenadas PDB de unión para cada tipo de simetría se agruparon y sus ángulos se analizaron en DSSR52. Los ángulos medios en todas las uniones dentro de los grupos fueron 56,05° (σ = 1,63) y 56,59° (σ = 1,50) para P32 y P3221, respectivamente (Tabla complementaria 7). Presumimos que incluso una pequeña diferencia en los ángulos de unión podría tener un efecto global significativo en el ensamblaje de la red, eliminando así la tensión en las redes P3221.

Paralelamente, empleamos el sistema J1 4 × 6 (3.05 Å) informado anteriormente, con simetría P3216. Se examinaron las 36 secuencias de uniones y se identificaron uniones fatales consistentes. Diecisiete de las 36 uniones cristalizaron con éxito, una tasa de éxito del 47% (Figura complementaria 8 y Tabla complementaria 8). A diferencia del motivo 4 × 5, casi todas las secuencias de unión 4 × 6 tenían una fuerte preferencia por la cristalización en tampones que contenían sales ≥2,0 M (p. ej., LiCl, Li2SO4, KCl y NaCl), y la mayoría prefería condiciones de pH ligeramente básicas. en ácido cacodílico (Tabla complementaria 9). No vimos mejoras apreciables en la resolución; sin embargo, en cinco casos (J4, 5, 31, 33 y 36), la unión alteró la simetría de trigonal (P32) a romboédrica (R3). Además, J4 y J36 cristalizaron exclusivamente en R3, pero J5, 31, 33 exhibieron la capacidad de cristalizar tanto en P32 como en R3 (Fig. 9 complementaria). En estos escenarios, R3 prefirió bajas concentraciones de iones divalentes y solventes orgánicos, y P32 requirió un alto contenido de sal (Tabla complementaria 10) con redes drásticamente diferentes (Figura complementaria 10). En comparación con las uniones que no produjeron cristales en el sistema 4 × 5, seis (J11, 12, 13, 17, 18 y 27) uniones resultaron fatales de manera constante (Tabla complementaria 11), y sugerimos que estas secuencias podrían ser considerado opciones imprudentes para futuras decisiones de diseño.

Las constantes de celda promedio para los cristales P32 fueron a = b = 68,29 Å c = 55,68 Å. El eje c, en particular, era ~ 5 Å más corto y tenía un grado de variabilidad mucho mayor (σ = 1.97), que aquellos que cristalizaron usando el motivo 4 × 5 (Tabla complementaria 12). El amplio rango del eje corto abarcó desde 52,77 a 60,36 Å, y postulamos que las longitudes flexibles del eje podrían ser responsables de hacer que un mayor número de cruces sean fatales que el sistema 4 × 5. En los cristales que contenían simetría R3, la celda promedio para cada uno era a = b = 114,9 Å c = 49,77 Å con el eje c confinado a un régimen más estricto (σ = 0,75). Los volúmenes de la cavidad también fueron marcadamente diferentes de los volúmenes de la cavidad P32 (~ 614.7 nm3) en comparación con ~ 532.1 nm3 en la estructura R3 más densamente empaquetada (consulte la Fig. 11 complementaria para obtener detalles de cálculo). Los ángulos de unión promedio de 54,60° (σ = 1,44) y 58,37° (σ = 2,3) para las simetrías P32 y R3, respectivamente (Tabla complementaria 13), junto con su preferencia por sales o solventes orgánicos, probablemente fueron los principales factores contribuyentes que produjo las redes divergentes.

Debido a que el sistema 4 × 6 produjo simetría R3 en 5 de 17 uniones, consideramos si las secuencias aguas abajo adyacentes a la unión podrían desempeñar un papel en la eficiencia de cristalización, el ángulo de unión y la preferencia de simetría, o si el HJ solo era el determinante singular. Para investigar esta posibilidad, diseñamos secuencias "revueltas" con sustituciones de bases específicas (Fig. 12 complementaria), manteniendo el contenido de GC, a lo largo de cada "tallo" (Fig. 3a, b). Contrariamente a la preferencia de búfer observada con los cristales P32 nativos, los sistemas codificados exhibieron una preferencia exclusiva hacia los tampones bajos en sal (Fig. 13 complementaria y Tabla complementaria 14), al igual que los cristales R3 nativos. Sorprendentemente, solo J1 y J2 conservaron la simetría P32, y todos los demás produjeron una red R3 (Tabla complementaria 15). También cabe destacar que J1 y J2 (P32), junto con los sistemas R3, también compartían una preferencia por las condiciones de baja salinidad, a diferencia de los cristales P32 originales. Este cambio en la preferencia del búfer sugiere que el contenido de la secuencia global puede influir en el comportamiento de autoensamblaje. Además, observamos mejoras modestas en la resolución, alcanzando hasta 2,7 Å en J36. En particular, todas las uniones que impedían la cristalización en comparación con su contraparte original permanecieron fatales (Tabla complementaria 16) y todas las dimensiones y volúmenes relativos de la cavidad permanecieron imperturbables (Figuras complementarias 14 y 15).

una vista estereoscópica de una superposición de la estructura de unión J10 utilizando el motivo de secuencia original de 4 × 6 con simetría P32 (gris), con la versión de secuencia codificada que contiene simetría R3 (verde azulado). Las secuencias modificadas se ubicaron dentro de las dos regiones de tallo aguas abajo (1 y 2; indicadas) que contenían el mismo contenido de GC que la versión de secuencia original de 4 × 6. El efecto de la secuencia codificada en la geometría de la unión es visualmente evidente cuando se comparan las regiones superpuestas de los Vástagos 1 y 2. La diferencia dramática en el ángulo de unión y su influencia en la simetría es evidente (Fig. 15 complementaria). b Vista estereoscópica de una representación lineal de las estructuras J10 superpuestas en (a) con todos los sitios de modificación de la base entre la versión original y la secuencia codificada de las estructuras J10 de 4 × 6 indicadas en los tallos 1 y 2. Se incluyen asteriscos para llamar la atención sobre la regiones de extremos pegajosos que divergen significativamente como resultado aparente de los ángulos inducidos por las secuencias de tallo modificadas. Los átomos se indican mediante lo siguiente: carbono (verde azulado), nitrógeno (azul), oxígeno (rojo) y fosfato (naranja). Todas las regiones que contienen secuencias idénticas se dejan translúcidas.

El papel de los efectos de secuencia de mayor alcance en los ángulos de unión sigue siendo una pregunta abierta en gran medida, pero el efecto en nuestro sistema cristalino es significativo. Parecía haber solo una diferencia marginal en las longitudes de celda promedio en los cristales revueltos R3 (a = b = 113.04 c = 51.10; Tabla complementaria 17) en relación con las secuencias nativas de 4 × 6 (Tabla complementaria 12): el a, b El eje tendía ~ 2 Å más corto yc ~ 1.3 Å más largo, mientras que en los casos J1 y J2, los cristales estaban en buen acuerdo con el motivo original de 4 × 6. Los ángulos medios de los cristales R3 y P32 fueron 61,00° (σ = 1,21) y 58,05° (σ = 1,39), respectivamente. Aunque el ángulo promedio en los cristales R3 es casi 3° más alto que los de la secuencia nativa (Tabla complementaria 18), el ángulo de la secuencia codificada se calcula a partir de un tamaño de muestra más grande que el ángulo más pequeño calculado en las estructuras nativas de 4 × 6 (58.37 °), con una desviación estándar significativamente mayor (2.33). Por el contrario, el ángulo calculado para los cristales P32 fue de 58,05° (n = 2, σ = 1,39), en comparación con 54,60° (n = 16, σ = 1,44), un promedio menos preciso debido a un tamaño de muestra pequeño, por lo que postula que 54,60° refleja más fielmente los ángulos promedio observados en los sistemas 4 × 6.

Anteriormente informamos15 la presencia de iones de arsénico en dos posiciones opuestas (Pos1 y 2, Figs. complementarias 16 y 17) de la unión, debido al ácido cacodílico contenido en el tampón de cristalización (Fig. 4). En varios casos, también observamos una agrupación de iones (Pos3; Fig. 17 complementaria) dentro del surco menor vecino a Pos2, pero no compartimos interacciones aparentes con la unión. Pos1 y 2 fueron fácilmente observables en los mapas de densidad de electrones en uno o ambos de estos sitios conservados en un número significativo de estructuras, sin respeto aparente por el motivo o la simetría (Fig. 4). Aunque en la mayoría de los casos, las uniones individuales, independientemente de los parámetros de diseño, tenían preferencia por cristalizar en ácido cacodílico dentro del régimen de pH de 6,0 a 6,5, no todos los cristales se limitaron a este requisito. En el sistema 4 × 5, J25 y J34, ambos con simetría P32, cristalizaron en tampón Tris 50 mM pH = 8,0 que contenía hexamina de cobalto (CoH18N6) y MgCl2 10 mM, y HEPES 50 mM pH = 7,5 con MgCl2 20 mM, respectivamente. Solo el cobalto podría explicar los diferentes picos en los mapas Fo-Fc en J25, mientras que en J34, J22 y J23 en los sistemas de aleatorización 4 × 6 y 4 × 6, respectivamente, contenían Mg2+. Los iones modelados se superpusieron fácilmente y estaban bien coordinados en Pos1 y 2 (Fig. 18 complementaria).

Vista estereoscópica, usando J21 en el sistema 4 × 5, la densidad de electrones 2Fo–Fc que representa las bases en las regiones de cruce están contorneadas en σ = 2.0, y las posiciones de iones individuales 1 y 2 (indicadas Pos1 y Pos2) están contorneadas independientemente en la densidad de electrones correspondiente en σ = 4.0. La presencia de arsénico en estos sitios se comprobó transfiriendo los cristales a TAE-Mg2+ (Tris 40 mM, acetato 20 mM y EDTA 1 mM pH = 8,6) y congelando posteriormente los cristales. Los cristales se escanearon en el borde K de arsénico (λ = 1,04 Å) donde estaba presente el pico de arseniato correspondiente. Ningún otro componente dentro de los tampones de cristalización podría explicar los picos resultantes en los mapas de diferencia Fo-Fc para los iones en sus sitios correspondientes. Los átomos se indican mediante lo siguiente: carbono (gris), nitrógeno (azul), oxígeno (rojo), fosfato (naranja) e iones de arsénico (esferas verdes).

Se realizaron simulaciones MD atomísticas completas para los 36 HJ inmóviles para explorar su dinámica en solución y comparar las propiedades de las uniones cristalizantes y no cristalizantes (consulte la sección "Métodos" en la Información complementaria para obtener detalles técnicos completos). En más de 224 μs de simulaciones, el rendimiento del campo de fuerza se consideró satisfactorio, ya que se observaron emparejamientos de bases estables y topologías helicoidales en forma de B de acuerdo con nuestros experimentos cristalográficos y estudios anteriores28,53,54,55. Las simulaciones revelaron diferencias relativamente menores en la dinámica interhelicoidal entre los 36 HJ inmóviles. Presentamos los valores del ángulo medio, así como los histogramas de las poblaciones de ángulos en la Tabla complementaria 19 y la Figura complementaria 18, respectivamente. El ángulo interhelicoidal fluctuó rápidamente en la escala de tiempo de microsegundos, lo que refleja la mayor libertad conformacional de las HJ en solución. Su valor medio fue típicamente más bajo que el observado en los cristales de ADN autoensamblados informados en este trabajo, lo que probablemente refleja una influencia genuina de los entornos respectivos (red cristalina versus solución libre), ya que los valores de simulación son más consistentes con los informados. para estructuras de rayos X de HJs56 aislado. Aún así, para la mayoría de los HJ la diferencia fue de menos de 5°. Notamos que los valores y distribuciones de ángulos interhelicoidales más inusuales se observaron para las uniones J11 y J18, las cuales nunca cristalizaron. La dinámica interhelicoidal excesiva y las preferencias de ángulo incompatibles con la estructura reticular podrían ser un factor que contribuya a la inhibición del crecimiento de cristales para estas dos uniones específicas.

La diferencia más significativa entre las uniones individuales observadas en las simulaciones MD fue su capacidad para formar distintos sitios de unión de iones de potasio cerca del punto de ramificación de la unión. En todos los casos, el ion formó un puente entre el fosfato justo en el punto de ramificación y una o dos bases más cercanas. Estos sitios estaban en buen acuerdo con los sitios Pos1 y Pos2 observados en las estructuras cristalinas experimentales (Figs. 4 y 5a). Dado que los átomos de base de los pares de bases del punto de ramificación estaban involucrados en la coordinación de iones, los sitios de unión de iones eran muy diferentes entre los 36 HJ inmóviles. La diferencia más obvia y llamativa fue que los HJ que nunca cristalizaron en nuestros experimentos (J11, 12, 13, 18 y 27) también fueron aquellos que consistentemente no mostraron la capacidad de formar estos sitios de unión de iones específicos en las simulaciones. J17, que tampoco cristalizó nunca, lo hizo en una porción insignificante (0.02%) de todos los marcos de simulación (Fig. 5b). Todos los demás HJ cristalizaron en nuestros experimentos y formaron estos sitios de unión de iones en nuestras simulaciones hasta cierto punto (Fig. 5b). La incidencia media de unión en las uniones no fatales fue de 0,53 (σ = 0,28), lo que sugiere que la capacidad de capturar iones es fundamental para la capacidad de cristalizar las HJ inmóviles. Especulamos que el sitio de unión de iones del punto de ramificación podría estabilizar el intercambio de cadenas de ADN durante la formación de la red y, por lo tanto, facilitar el crecimiento del cristal. Esta hipótesis está respaldada por el hecho de que las uniones incapaces de formar este sitio de unión iónica, o aquellas que lo hacen en menor grado, se encuentran, en consecuencia, entre aquellas que no forman cristales en absoluto o que son más sensibles a la cristalización. condiciones. La única excepción fue J7 que, a pesar de poseer una secuencia de puntos de ramificación adecuada para hacerlo, no formó el sitio de unión de iones en simulaciones o experimentos, pero aún pudo cristalizar.

a Estructuras superpuestas de la estructura cristalina J10 de 4 × 5 (gris translúcido) con una instantánea de la simulación J10 en solución (bronceado). Los sitios de unión de arsénico (esferas verdes) en la estructura cristalina cerca del punto de ramificación se superponen con los sitios de unión de potasio (esferas azules) formados espontáneamente en las simulaciones de la estructura de la solución. b Gráficos que muestran la incidencia de la captura de iones cerca del punto de ramificación en simulaciones de las 36 secuencias de unión. Las uniones "fatales" de consenso (J11, 12, 13, 17, 18 y 27) no muestran capacidad para la captura de iones con la excepción de J17 (asterisco) que lo hizo en un grado insignificante en comparación con las uniones de cristalización. Todas las demás uniones que dieron como resultado cristales demostraron la capacidad de capturar iones en un grado significativo, con solo un único valor atípico (J7, diamante). J7 cristalizó sólidamente, pero no mostró capacidad para capturar iones tanto en experimentos como en simulaciones, lo que sugiere que la unión de iones no es esencial para la cristalización de esta unión única.

Inicialmente, podría haber una aparente contradicción asociada con la presencia de arsénico detectada experimentalmente a partir de un anión cacodilato en la región donde las simulaciones localizan los cationes K+ (Fig. 5). Sin embargo, sugerimos que estas observaciones pueden reconciliarse. Hasta donde sabemos, todas las estructuras experimentales de HJ en la base de datos PDB informadas por diversos grupos independientes sugieren que los cationes (p. ej., Na+, Mg2+, Sr2+, Ba2+) deberían unirse en esta ubicación. Este resultado es consistente con el potencial de interacción molecular altamente negativo (Fig. 20 complementaria) calculado aquí, que es un sello distintivo de los sitios de unión de cationes. Sin embargo, en la mayoría de las estructuras cristalinas informadas aquí, el anión cacodilato encaja mejor en el mapa de densidad de electrones de nuestras estructuras de rayos X, debido a la presencia de cacodilato de sodio en la solución de cristalización (Fig. 21 complementaria). Ningún otro componente de amortiguamiento podría formar distancias de contacto razonables en esta ubicación con la unión misma. En nuestro trabajo anterior15 se ha descrito una descripción completa de la evidencia experimental exhaustiva de este arsénico. Este resultado aparentemente contrario a la intuición se puede racionalizar de varias maneras: primero, el cacodilato podría estabilizarse en este sitio mediante enlaces de hidrógeno e interacciones con el solvente, los cuales se sabe que brindan estabilización para la unión aniónica incluso en regiones con potenciales de superficie negativos57,58 . En segundo lugar, podría haber uno o más contraiones de sodio asociados (catenados) con cacodilato en este sitio. Se sabe que los aniones cacodilatos forman interacciones con segmentos de ácidos nucleicos cargados negativamente de esta manera59,60. Por último, podría haber múltiples iones Na+ (el contraión del cacodilato) presentes alrededor del anión. Debido a la resolución nominal de nuestras estructuras, que está en el rango de ~3 Å, no es posible identificar sin ambigüedades todas las especies que interactúan, ni es posible describir completamente la coordinación exacta, como la participación de moléculas de agua y Na+. . La unión de Na+ podría compensar o incluso sobrecompensar la carga negativa del cacodilato, recreando efectivamente el sitio común de unión de cationes que se observa en las simulaciones y otras estructuras experimentales. Los iones de Na+ a menudo fluctúan y sus requisitos de coordinación son flexibles, lo que los hace totalmente invisibles para nosotros. Además, como lo sugieren las simulaciones, podría haber una dinámica local significativa que oscurezca las densidades con el promedio. Las simulaciones anteriores de MD informaron sitios de unión de Na+ altamente variables, de rígidos a dinámicos, alrededor de los ácidos nucleicos61, y es muy posible que los cationes Na+ invisibles puedan unir el anión cacodilato con los grupos carbonilo y fosfato del ADN. Si bien la incapacidad para describir el sitio de interacción con mayor detalle es una limitación del trabajo actual, está muy claro que el alojamiento de iones en esta ubicación es un requisito estricto para que la unión se estabilice y cristalice de manera efectiva.

En este trabajo, informamos un estudio sistemático de las 36 secuencias HJ inmóviles en dos sistemas de cristal diferentes, hallazgos que, en principio, pueden extenderse a cualquier cristal de ADN 3D y potencialmente a otros tipos de arquitecturas de ADN. Mostramos que J1 (o cualquier otro cruce) no debe considerarse una opción privilegiada para diseñar celosías autoensambladas. Más bien, se debe explorar una gran cantidad de otras combinaciones de secuencias discutidas en este documento, y muchas de ellas proporcionan un rendimiento potencialmente superior. Hacemos la observación esencial de que varias uniones, incluidas J11, 12, 13, 17, 18 y 27, son universalmente fatales para la cristalización y deben evitarse en futuros diseños de cristales, a menos que se consideren isómeros alternativos. Otra observación importante es la importancia de las secuencias de la región del tallo fuera del HJ, dado que esta secuencia puede controlar la simetría del cristal y la arquitectura de la red, y mejorar la resolución de formas no obvias. También aclaramos el papel clave de la coordinación de iones en la conducción de estos efectos. Ampliar las nanoestructuras de ADN a ensamblajes más grandes, para cristales de ADN, así como redes 1D y 2D, y potencialmente sistemas de origami de ADN, probablemente requerirá tener en cuenta los efectos dependientes de la secuencia tanto a nivel de geometrías de tallo como HJ. Finalmente, las distribuciones de ángulos obtenidas de nuestros estudios MD de uniones pueden mejorar la precisión de los modelos de grano grueso y las herramientas de diseño de nanotecnología de ADN para representar nanoestructuras con mayor precisión.

En resumen, nuestros resultados experimentales están corroborados por la simulación MD (agregado de 224 μs) a mayor escala realizada hasta la fecha en HJ. Las simulaciones aclararon el papel de la flexibilidad dependiente de la secuencia y los efectos del solvente en las conformaciones HJ. Este trabajo también demuestra que la secuencia HJ juega un papel no trivial en la capacidad de formación de los cristales de ADN y puede influir drásticamente en la simetría de los cristales. Además, hemos proporcionado un estudio sistemático y completo de la estructura de la secuencia en sistemas de cristales de ADN autoensamblados utilizando las 36 uniones. Por último, el estudio reveló inesperadamente interacciones moleculares específicas (unión de iones) utilizando parámetros tanto experimentales como de modelado, que nunca se habían realizado a esta escala.

Todos los oligonucleótidos se adquirieron de Integrated DNA Technologies (Coralville, Iowa) y se purificaron usando electroforesis en gel de poliacrilamida desnaturalizante al 14% (PAGE) o HPLC. Después de la purificación, el ADN sedimentado se resuspendió en H2O nanopura y se lavó 5 veces usando filtros de corte de peso molecular de 3 kDa (Amicon) para eliminar cualquier sal restante. Se hizo una reserva de las hebras de tres componentes (S1:S2:S3) con concentraciones finales de 30:120:120 µM para cada construcción. El método de difusión de vapor de gota sentada se realizó con placas Cryschem (Hampton Research) utilizando una adaptación de una pantalla de cristalización de ADN descontinuada de un proveedor comercial (Sigma Aldrich) que contenía una matriz dispersa de 48 condiciones (Tabla complementaria 3). Se agregaron 500 µL de cada condición correspondiente a cada reservorio y se preparó un volumen de gota total de 6 µL que contenía una mezcla de una proporción de 2:1 de stock de ADN a la solución del reservorio correspondiente con una concentración de gota final de 30 µM. Para las uniones donde la cristalización era un desafío, se realizaron múltiples rondas de detección utilizando la pantalla de matriz dispersa de 48 condiciones (Tabla complementaria 3) variando las condiciones, como la concentración de ADN, el pH del tampón, la concentración de sal y los tiempos de hibridación para permitir una determinación confiable de la eficacia de la unión. Luego, las placas se colocaron en una incubadora de enfriamiento (Torrey Pines Scientific, Carlsbad, CA) y se dejaron equilibrar a 60 °C durante 1 h y luego se enfriaron usando un gradiente lineal a 25 °C a una velocidad de 0,3 °C/h. . Se tomaron imágenes de los cristales resultantes con un microscopio óptico (Figuras complementarias 6, 9, 10) y luego se crioprotegieron con una madre artificial suplementada con 30 % de glicerol mediante adición directa a la gota. Posteriormente, los cristales se recogieron utilizando crio-bucles (Hampton Research) y se crioenfriaron sumergiéndolos inmediatamente en un baño de nitrógeno líquido. Todos los datos se recopilaron en una corriente fría de nitrógeno (100 K) en las líneas de luz correspondientes indicadas en la Tabla complementaria 1.

Todos los datos de difracción se procesaron en HKL200062, y las fases iniciales se calcularon utilizando el reemplazo molecular en Phaser63 del conjunto de programas PHENIX64 con las estructuras J1 4 × 5 5KEK y 6X8C, como modelos de búsqueda inicial para las estructuras dúplex y de unión, respectivamente. , y las estructuras J1 4 × 6 5VY6 y 6XNA para las estructuras dúplex y de unión que contienen simetría P32 en ese sistema, respectivamente. Sin embargo, con pocas excepciones, la mayoría de los cristales de simetría R3 de 4 × 6 requerían otro modelo R3 de uno de sus homólogos como modelo de búsqueda ideal. Se realizaron múltiples rondas de construcción de modelos en Coot, con el modelo inicial tratado primero como un solo cuerpo rígido, seguido de rondas iterativas posteriores usando refinamiento restringido en REFMAC65 desde CCP466, junto con espacio real y cálculo de coordenadas XYZ en phenix.refine. Todos los iones se modelaron en regiones de densidad de diferencia Fo-Fc con un nivel de contorno ≥ σ = 3,0 y se refinaron. Luego se refinaron las ocupaciones atómicas y los cálculos del factor B, junto con el recocido simulado para concluir el refinamiento. Todos los modelos refinados utilizaron un conjunto Rfree que contenía del 5 al 10 % de los reflejos únicos para cada estructura. Las coordenadas y los factores de estructura, que suman 134 estructuras únicas, se depositaron en el Banco de datos de proteínas (PDB), y los códigos de acceso correspondientes se enumeran en la Tabla complementaria 20. Las estadísticas de recopilación y refinamiento de datos se resumen en la Tabla complementaria 1, que se divide según a sus respectivos sistemas cristalinos. Todo el texto principal y las cifras de la estructura de información complementaria contenidas en este informe se prepararon utilizando PyMOL67.

Hemos utilizado la estructura de la unión J1 cristalizada en geometría de celosía 4 × 5 (PDB:5KEK)15 como estructura inicial para todas las simulaciones. Cada brazo del HJ se extendió para contener al menos ocho pares de bases, con las partes extendidas de las hélices tomadas de las celdas adyacentes de la red cristalina. El constructo resultante contenía 64 nucleótidos y se usó como estructura inicial para simulaciones de las 36 secuencias de unión inmóvil, sustituyendo los pares de bases del punto de ramificación en consecuencia. Hemos utilizado el módulo xLeap de AMBER1868 para preparar la topología y los archivos de coordenadas. El último campo de fuerza de ADN AMBER OL1569 se utilizó en todas las simulaciones informadas. Durante la revisión, también probamos el campo de fuerza de ADN parmbsc1 alternativo70 para un subconjunto de los HJ; sin embargo, con bsc1 detectamos una población significativa de conformaciones de columna vertebral β/γ g + /t no nativas y posiblemente falsas (consulte la Fig. 22 complementaria y el texto adjunto (Discusión complementaria 1). Esta observación también es consistente con informes recientes71. Por lo tanto, sugerimos que para el sistema actual, el campo de fuerza OL15 podría ser la elección óptima. Cada estructura HJ se solvató en una caja octaédrica de moléculas de agua SPC/E72 con una distancia mínima de 16 Å entre el soluto y el borde de la caja (Fig. 23). La concentración de sal de 0,15 M se estableció mediante la adición de iones KCl 73. Las posiciones relativas de los iones se compararon luego con los sitios de iones en las estructuras cristalinas. Aunque las condiciones de MD y la descripción de la unión de iones no son idénticas a las condiciones experimentales , las simulaciones deberían reflejar de manera bastante realista las propensiones generales relativas de las diferentes secuencias para formar el sitio de unión de iones A continuación, realizamos el equilibrio de preproducción y la minimización de cada sistema. La primera minimización se realizó con una restricción posicional de 25 kcal/mol/Å2 colocada en el ADN, seguida de una corrida de equilibrio usando la misma restricción posicional en la que el sistema se calentó de 100 a 300 K en una escala de tiempo de 10 ps. Esto fue seguido luego por una serie de seis minimizaciones y ciclos de equilibrio con 5, 4, 3, 2, 1 y, finalmente, 0,5 kcal/mol/Å2 de restricción posicional colocada en el ADN. Cada minimización constaba de 500 pasos usando el método de descenso más pronunciado seguido de 500 pasos usando el método de gradiente conjugado. Cada equilibración, excepto la primera, se realizó durante 5 ps. Para todas las uniones que no sean J1, se tomó un paso adicional de minimización al principio para optimizar la geometría inicial de los pares de bases del punto de ramificación. Las simulaciones de producción se realizaron con pmemd.cuda74, utilizando condiciones de contorno periódicas y conjunto NPT, y el protocolo de simulación estándar75. La duración de cada simulación fue de 1 μs y se realizaron cuatro simulaciones independientes para las 36 uniones. Luego, las simulaciones de HJ seleccionados se extendieron hasta 20 μs para verificar la convergencia (Figura complementaria 24a, b). Los análisis se realizaron con cpptraj y VMD76,77, utilizando el conjunto de simulación combinado de cada cruce individual. Los ángulos interhelicoidales de las uniones en las simulaciones se midieron como parámetros de Jtwist de acuerdo con la definición descrita previamente por Watson et al.56 donde los dos ejes helicoidales de los brazos helicoidales apilados de la unión están representados por un vector y la Jtwist calculada como su punto producto de ángulo Tenga en cuenta que nuestras simulaciones muestrearon transiciones entre cruces de mano derecha e izquierda que, sin embargo, tienen los mismos valores de Jtwist asignados por Watson et al. definición de 2004. Para diferenciar la lateralidad, definimos un vector adicional perpendicular al punto de ramificación de la unión y luego lo usamos para calcular el producto del ángulo de punto con el vector de producto cruzado de los dos vectores que representan los ejes helicoidales. El valor de este segundo ángulo de punto se usó luego para diferenciar la lateralidad de la unión con valores por encima y por debajo de 90° correspondientes a uniones de mano derecha e izquierda, respectivamente. Los valores de Jtwist de las estructuras zurdas se normalizaron posteriormente en −1.

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen de informes de investigación de Nature vinculado a este artículo.

Todas las coordenadas y factores de estructura generados en este estudio se han depositado en la base de datos de proteínas RCSB con los siguientes códigos de acceso (4 × 5 estructuras dúplex: J1-5KEK, J3-6WQG, J5-6WRB, J6-6X8B, J7-6WSN, J8-6WSO, J9-6WSP, J10-6WSQ, J14-6WSR, J15-6WSS, J16-6WST, J19-6WSU, J20-6WSV, J21-6WSW, J22-6WSX, J23-6WSY, J24-6WSZ, J25- 6WT0, J26-6WRJ, J28-6WRI, J29-6WT1, J31-6WRC, estructuras de unión 4 × 5: J1-6X8C, J3-6XDV, J5-6XDW, J6-6XDX, J7-6XDY, J8-6XDZ, J9- 6XEI, J10-6XEJ, J14-6XEK, J15-6XEL, J16-6XEM, J19-6XFC, J20-6XFD, J21-6XFE, J22-6XFF, J23-6XFG, J24-6XFW, J25-6XGM, J26-6XFX, J28-6XFY, J29-6XFZ, J31-6XG0, J32-6XGJ, J33-6XGN, J34-6XGO, J35-6XGK, J36-6XGL, estructuras dúplex 4×6 con simetría P32: J1-5VY6, J2-7JPB, J5 -7JPA, J7-7JPC, J8-7JP9, J10-7JP8, J16-7JP7, J20-7JP6, J22-7JP5, J23-7JON, J24-7JOL, J26-7JOK, J28-7JOJ, J30-7JOI, J31-7JOH , J33-7JOG; estructuras de unión 4 × 6 con simetría P32: J1-6XNA, J2-7JFT, J5-7JFU, J7-7JFV, J8-6XO5, J10-7JFW, J16-7JFX, J20-7JH8, J22-7JH9, J23-7JHA, J24-7JHB, J26-7JHC, J28-6XO6, j30-6XO7, J31-6XO8, J33-6XO9; Estructuras dúplex 4 × 6 con simetría R3: J4-7JRY, J5-7JRZ, J31-7JS0, J33-7JS1, J36-7JS2; Estructuras de unión 4 × 6 con simetría R3: J4-7JHR, J5-7JHS, J31-7JHT, J33-7JHU, J36-7JHV; Estructuras dúplex codificadas 4×6: J1-7JKD, J2-7JKE, J3-7JKG, J5-7JKH, J7-7JKI, J8-7JKJ, J10-7JKK, J14-7JL9, J16-7JLA, J19-7JLB, J21-7JLC , J22-7JLD, J23-7JLE, J24-7JLF, J26-7JNJ, J30-7JSB, J31-7JSC, J33-7JNK, J34-7JNL, J36-7JNM; Estructuras de unión codificada 4 × 6: J1-7JK0, J2-7JJZ, J3-7JJY, J5-7JJX, J7-7JJW, J8-7JJ6, J10-7JJ5, J14-7JJ4, J16-7JJ3, J19-7JJ2, J21-7JIQ , J22-7JIP, J23-7JIO, J24-7JIN, J26-7JIM, J30-7JI9, J31-7JI8, J33-7JI7, J34-7JI6, J36-7JI5). Además, todos los códigos de acceso correspondientes se pueden encontrar en la Tabla complementaria 20. Los archivos de entrada y salida para los datos de simulación MD generados en este estudio se han depositado en la base de datos de Zenodo con el código de acceso: 6381939. Los datos de trayectoria de simulación MD sin procesar están disponibles en solicitud debido al gran tamaño de los conjuntos de datos.

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Los resultados que se muestran en este informe se derivan del trabajo realizado en Argonne Photon Source (APS), Advanced Light Source (ALS) y National Synchrotron Light Source II (NSLS-II). El Centro de Biología Estructural (SBC) de ANL en la Fuente Avanzada de Fotones (SBC-CAT) es operado por UChicago Argonne, LLC, para el Departamento de Energía de EE. UU. (DOE), Oficina de Investigación Biológica y Ambiental bajo el contrato DE-AC02-06CH11357. El Centro de Biología Estructural de Berkeley cuenta con el apoyo parcial del Instituto Médico Howard Hughes. El ALS es una instalación para usuarios de la Oficina de Ciencias del DOE según el contrato No. DE-AC02-05CH11231. Las líneas de luz ALS-ENABLE están respaldadas en parte por el NIH, Instituto Nacional de Ciencias Médicas Generales (NIGMS), subvención P30 GM124169. Resultados de las líneas de luz AMX (17-ID) y FMX (17-BM) en el NSLS-II, que es una instalación para usuarios de la Oficina de Ciencias del DOE operada para la Oficina de Ciencias del DOE por el Laboratorio Nacional de Brookhaven bajo el Contrato No. DE-SC0012704. El recurso de investigación de tecnología biomédica de ciencias de la vida cuenta con el apoyo principal del NIH, el NIGMS a través de una subvención P41 del recurso de investigación de tecnología biomédica (P41GM111244), la División de Investigación de Materiales de la Fundación Nacional de Ciencias (NSF2004250) y la Oficina de Investigación Biológica y Ambiental del DOE (KP1605010). ). Este trabajo fue apoyado en parte con los proyectos SYMBIT reg. número CZ.02.1.01/0.0/0.0/15_003/0000477 financiado por FEDER (MK y JS) y 21-23718S por la Fundación Checa para la Ciencia (MK y JS). NS reconoce los fondos iniciales de la Universidad Estatal de Arizona. HY, NS y PS agradecen el apoyo de la División de Investigación de Materiales de la Fundación Nacional de Ciencias (NSF2004250). HY también recibió el apoyo del Fondo de Iniciativa Estratégica Presidencial de la Universidad Estatal de Arizona.

Estos autores contribuyeron igualmente: Chad R. Simmons, Tara MacCulloch.

Centro de Biodiseño para Diseño Molecular y Biomimética, Universidad Estatal de Arizona, 1001S. McAllister Ave, Tempe, AZ, 85287, EE. UU.

Chad R. Simmons, Tara MacCulloch, Michael Matthies, Alex Buchberger, Ilyssa Crawford, Petr Šulc, Nicholas Stephanopoulos y Hao Yan

Facultad de Ciencias Moleculares, Universidad Estatal de Arizona, Tempe, AZ, 85287, EE. UU.

Tara MacCulloch, Alex Buchberger, Ilyssa Crawford, Petr Šulc, Nicholas Stephanopoulos y Hao Yan

Instituto de Biofísica de la Academia Checa de Ciencias, Královopolská 135, 612 65, Brno, República Checa

Miroslav Krepl y Jiří Šponer

Centro Regional de Tecnologías y Materiales Avanzados, Instituto Checo de Investigación y Tecnología Avanzada (CATRIN), Universidad Palacky Olomouc, Slechtitelu 241/27,783 71, Olomouc, República Checa

Miroslav Krepl y Jiří Šponer

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CRS y HY concibieron el proyecto. TM, AB e IF purificaron todo el ADN y prepararon todos los cristales utilizados en el trabajo bajo la dirección de CRS y NS, y CRS realizó todos los análisis de datos cristalográficos y la solución y el refinamiento de la estructura. MK, JS y PS concibieron todos los experimentos de simulación de dinámica molecular, y MK realizó el análisis de los datos de simulación. MM realizó el análisis experimental de todos los ángulos de unión bajo la dirección de PS. Todos los autores discutieron los resultados y proporcionaron comentarios sobre el manuscrito. , CRS y TM prepararon todas las cifras, y CRS, MK, NS y HY escribieron el artículo.

Correspondencia a Nicholas Stephanopoulos o Hao Yan.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Nature Communications agradece a Vlasis Mavrantzas y a los demás revisores anónimos por su contribución a la revisión por pares de este trabajo. Los informes de los revisores están disponibles.

Nota del editor Springer Nature se mantiene neutral con respecto a los reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

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Reimpresiones y permisos

Simmons, CR, MacCulloch, T., Krepl, M. et al. La influencia de la secuencia y la dinámica de la unión de Holliday en el autoensamblaje del cristal de ADN. Nat Comun 13, 3112 (2022). https://doi.org/10.1038/s41467-022-30779-6

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Recibido: 27 de octubre de 2021

Aceptado: 04 mayo 2022

Publicado: 03 junio 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-022-30779-6

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